Las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real ( MIQE ) son un conjunto de protocolos para realizar y notificar experimentos y datos de PCR cuantitativos en tiempo real , según lo ideado por Bustin et al. en 2009. [1] Fueron ideados después de que se publicara un artículo en 2002 que afirmaba detectar el virus del sarampión en niños con autismo mediante el uso de RT-qPCR, pero los resultados demostraron ser completamente irreproducibles por otros científicos. [2] Los propios autores tampoco intentaron reproducirlos y se descubrió que los datos sin procesar tenían una gran cantidad de errores y errores básicos en el análisis. Este incidente llevó a Stephen Bustin a crear las directrices MIQE para proporcionar un nivel básico de calidad para los datos de qPCR publicados en la literatura científica. [2]
Las directrices MIQE se crearon debido a la baja calidad de los datos de qPCR enviados a las revistas académicas en ese momento, lo que se estaba volviendo más común a medida que la maquinaria de secuenciación de próxima generación permitía realizar tales experimentos a un costo más económico. Debido a que la técnica se utiliza en toda la ciencia en múltiples campos, los instrumentos, métodos y diseños de cómo se usa qPCR difieren mucho. Para ayudar a mejorar la calidad general, las pautas MIQE se formularon como sugerencias generalizadas sobre procedimientos experimentales básicos y formas de datos que deben recopilarse como un nivel mínimo de información reportada para que otros investigadores comprendan y utilicen al leer el material publicado. La comunidad científica consideró importante establecer un conjunto de directrices reconocidas y ampliamente acordadas como estas, especialmente debido a la cantidad cada vez mayor de trabajo científico procedente de países en desarrollo con muchos idiomas y protocolos diferentes. [3]
En 2009, Stephen Bustin dirigió un grupo internacional de científicos, incluido Mikael Kubista, para elaborar un conjunto de directrices sobre cómo realizar qPCR y qué tipos de datos deberían recopilarse y publicarse en el proceso. [1] Esto también permitió a los editores y revisores de revistas científicas emplear las pautas al revisar un artículo enviado que incluía datos de qPCR. Por lo tanto, las pautas se establecieron como una especie de lista de verificación para cada paso del procedimiento, con ciertos elementos marcados como esenciales (E) al enviar datos para publicación y otros marcados como simplemente deseables (D). [4]
En septiembre de 2010 se publicó una versión adicional de las directrices para su uso con PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. También sirvió de resumen de la forma más amplia de las directrices. [5] Otros investigadores han estado creando versiones adicionales para formas específicas de qPCR que pueden requerir un conjunto adicional o diferente de elementos para verificar, incluida la qPCR unicelular [6] y la PCR digital (dPCR). [7] También se ha revisado el cumplimiento adecuado de las directrices MIQE existentes en otras áreas científicas, incluida la fotobiomodulación [8] y los biomarcadores clínicos . [9]
Bustin señaló en 2014 (y nuevamente en 2017) que había cierta aceptación y uso de las pautas MIQE dentro de la comunidad científica, pero todavía había demasiados artículos publicados con experimentos de qPCR que carecían incluso de las características más avanzadas. fundamentos de presentación de datos y adecuada confirmación de efectividad de dichos datos. Estos estudios mantuvieron importantes problemas de reproducibilidad, donde las conclusiones de su evidencia no pudieron ser replicadas por otros investigadores, lo que puso en duda los resultados iniciales. Todo esto se produjo a pesar de que muchos artículos citan directamente la publicación MIQE original de Bustin, pero no siguen la lista de verificación de pautas de material en sus propios experimentos. [2] [10] Sin embargo, algunos investigadores han señalado al menos cierto éxito, con una serie de artículos que fueron rechazados por revistas académicas para su publicación debido a que no pasaron las listas de verificación MIQE. Otros estudios se retractaron después del hecho una vez que se notó y se señaló públicamente a los editores de la revista su falta de datos adecuados para aprobar las pautas MIQE. [11]
Al configurar sus nuevos sistemas qPCR comparativos titulados "Dots in Boxes" en 2017, New England Biolabs declaró que habían diseñado la parte de recopilación de datos en torno a las pautas MIQE para que los datos se ajustaran a todas las listas de verificación de parámetros mínimos en los protocolos. [12] Otras empresas de instrumentos científicos han contribuido al cumplimiento de las directrices adaptando intencionalmente sus dispositivos, incluida Bio-Rad, que creó una aplicación móvil que permite el marcado activo de la lista de verificación MIQE a medida que se completa cada paso. [13]
En junio de 2020 se realizó una descripción general del décimo aniversario desde la publicación de las directrices MIQE y se discutieron los estudios científicos que habían producido resultados mejores y más organizados al seguir las directrices. [14] En agosto de 2020, se publicó una versión actualizada de las directrices para el método de PCR digital para tener en cuenta las mejoras en maquinaria, tecnologías y técnicas desde la publicación original de 2013. Se agregaron pasos de guía adicionales para el análisis de datos, al mismo tiempo que se proporcionó una tabla de lista de verificación más simplificada para que la utilicen los investigadores. [15] En diciembre de 2020 se desarrolló un ensayo de direccionamiento de RT-qPCR junto con Stephen Bustin utilizando las pautas MIQE para biomarcadores clínicos con el fin de identificar la presencia clínica de partículas virales de COVID-19 durante la pandemia de COVID-19 . [dieciséis]
Las directrices MIQE se dividen en 9 secciones diferentes que conforman la lista de verificación. Estos incluyen no sólo consideraciones para realizar la qPCR en sí, sino también cómo se recopilan, analizan y presentan los datos resultantes. Una parte importante de esto último es incluir información relacionada con el software de análisis utilizado y también enviar los datos brutos a las bases de datos pertinentes. [1]
Gran parte de las pautas incluyen acciones básicas que normalmente se incluirían en experimentos y publicaciones de todos modos, como un elemento para describir las diferencias entre los grupos experimental y de control. Otra información similar incluye cuántas unidades individuales se utilizan en cada grupo en el experimento. Estas dos piezas se definen como imprescindibles para cualquier estudio. Esta sección también incluye dos puntos deseables, que son señalar si el laboratorio del autor o un laboratorio central de la universidad u organización realizó el ensayo qPCR y un reconocimiento a cualquier otra persona que haya contribuido al trabajo. [1]
Los requisitos esenciales que deben cumplir las muestras y el material de muestra incluyen una descripción de la muestra, qué forma de disección se utilizó, qué método de procesamiento se realizó, si las muestras se congelaron o fijaron y cuánto tiempo tomó, y qué condiciones de muestra se utilizaron. . También es deseable conocer el volumen o masa de la muestra que se procesó para la qPCR. [1]
Para el proceso de extracción del ADN/ARN existen una serie de pautas imprescindibles. Esto incluye una descripción del proceso de extracción realizado, una declaración sobre qué kit de extracción de ADN se utilizó y cualquier cambio realizado en las instrucciones, detalles sobre si se utilizó algún tratamiento con DNasa o RNasa , una declaración sobre si se evaluó alguna contaminación, una cuantificación de la cantidad de material genético extraído, una descripción de los instrumentos utilizados para la extracción, los métodos utilizados para conservar la integridad del ARN, una declaración sobre el número de integridad del ARN y el indicador de calidad y el ciclo de cuantificación (Cq) alcanzado y, por último, qué pruebas se realizaron. para determinar la presencia o ausencia de inhibidores . Cuatro datos deseados son de dónde se obtuvieron los reactivos utilizados, qué nivel de pureza genética se obtuvo, qué rendimiento se obtuvo y una imagen de gel de electroforesis para confirmación. [1]
Las principales partes esenciales para esta fase incluyen detallar las condiciones de reacción en su totalidad, dando tanto la cantidad de ARN utilizada como el volumen total de la reacción, dar información sobre el oligonucleótido utilizado como cebador y su concentración, la concentración y el tipo de transcriptasa inversa. utilizado y, por último, la temperatura y el tiempo transcurrido para la reacción. También es deseable tener los números de catálogo de los reactivos utilizados y sus fabricantes, la desviación estándar para la Cq con y sin la transcriptasa involucrada y cómo se almacenó el ADNc . [1]
Aquí es necesaria toda la información básica sobre el objetivo, incluido el símbolo del gen, el número de la base de datos de acceso para la secuencia en cuestión, la longitud de la secuencia que se está amplificando, información sobre la pantalla de especificidad utilizada, como BLAST , para qué variantes de empalme existen. la secuencia y dónde está el exón o intrón de cada cebador. Hay varias piezas de información deseadas, pero no requeridas, para esta sección, como la ubicación del amplicón , si existen pseudogenes u homólogos , si se realizó una alineación de secuencia y los datos obtenidos de ella, y cualquier dato sobre la estructura secundaria de la secuencia amplificada. [1]
La creación de los oligonucleótidos requiere sólo dos datos esenciales: las secuencias de cebadores utilizadas y la ubicación y los detalles de cualquier modificación realizada en la secuencia. Pero hay varios datos deseables, incluido el número de identificación de la base de datos RTPrimerDB, las secuencias de las sondas , el fabricante utilizado para fabricar los oligos y cómo se purificaron. [1]
Como uno de los segmentos principales de las pautas, hay varias partes esenciales en la lista de verificación para el proceso qPCR en sí. Esto incluye el conjunto completo de condiciones utilizadas para la reacción, el volumen tanto de la reacción como del ADNc, las concentraciones de las sondas, los iones de magnesio y los dNTP , qué tipo de polimerasa se utilizó y su concentración, qué kit se utilizó y su fabricante, qué aditivos para la reacción se utilizaron, quién fabricó la máquina qPCR y qué parámetros se establecieron para el proceso de termociclado . Los únicos datos adicionales deseados son la composición química del tampón utilizado, quién fabricó las placas y tubos utilizados y cuál es su número de catálogo, y si la reacción se configuró manualmente o mediante una máquina. [1] [17]
Para poder confirmar la efectividad y calidad del proceso qPCR que se realizó, son varias las acciones y datos posteriores que se deben presentar. Esto incluye explicar el método específico para comprobar que el proceso funcionó, como el uso de un gel, la secuenciación directa del material genético, la visualización de un perfil de fusión o la digestión mediante enzimas de restricción . Si se utilizó SYBR Green I , entonces se debe proporcionar la Cq del grupo de control sin ADN molde. Otros datos esenciales incluyen la calibración de las curvas de la máquina con la pendiente y la intercepción y anotadas, la eficiencia del proceso de PCR determinada a partir de la pendiente antes mencionada, los coeficientes de correlación (r al cuadrado) para las curvas de calibración, el rango dinámico de las curvas lineales. , el Cq se encontró en la concentración más baja donde el 95% de los resultados aún eran positivos ( LOD ) junto con la evidencia del LOD en sí y, por último, si se utiliza un múltiplex , entonces se debe proporcionar la eficiencia y el LOD para cada ensayo realizado. [1] [17]
La información adicional deseada incluye evidencia dado que la optimización de qPCR se produjo mediante el uso de gradientes, los intervalos de confianza para mostrar la eficiencia de la qPCR y los intervalos de confianza para todo el rango probado. [1]
La sección final de las pautas incluye información sobre cómo se realizó el análisis de los datos de qPCR. Las partes esenciales de eso incluyen el programa y la versión del programa utilizado para el análisis, el método para determinar el Cq, descubrir los puntos atípicos en los datos y cómo se usan o excluyen y por qué, qué resultados se encontraron para los controles. sin material genético modelo, una explicación de por qué se eligieron los genes de referencia utilizados y por qué se eligió el número de ellos, el método utilizado para normalizar los datos, cuántas réplicas técnicas se incluyeron, qué tan repetibles fueron los datos dentro de los ensayos, qué Se utilizaron métodos para determinar la importancia de los resultados y qué software se utilizó para esta parte del análisis cualitativo. [1]
También se desea incluir información sobre el número de réplicas biológicas y si coincidieron con los resultados de las réplicas técnicas, los datos de reproducibilidad de las variantes de concentración, datos sobre el análisis de potencia y, por último, que los investigadores envíen los datos sin procesar en el Formato de archivo RDML. [1] [18]