Un inmunoensayo ( IA ) es una prueba bioquímica que mide la presencia o concentración de una macromolécula o una pequeña molécula en una solución mediante el uso de un anticuerpo (generalmente) o un antígeno (a veces). La molécula detectada por el inmunoensayo suele denominarse " analito " y en muchos casos es una proteína , aunque puede tratarse de otro tipo de moléculas, de diferentes tamaños y tipos, siempre que se encuentren los anticuerpos adecuados que tengan las propiedades requeridas para se desarrollan los ensayos. Los analitos en líquidos biológicos como el suero o la orina se miden frecuentemente mediante inmunoensayos con fines médicos y de investigación. [1]
Los inmunoensayos vienen en muchos formatos y variaciones diferentes. Los inmunoensayos se pueden realizar en múltiples pasos con reactivos que se agregan y se lavan o separan en diferentes puntos del ensayo. Los ensayos de varios pasos a menudo se denominan inmunoensayos de separación o inmunoensayos heterogéneos. Algunos inmunoensayos se pueden realizar simplemente mezclando los reactivos y las muestras y realizando una medición física. Estos ensayos se denominan inmunoensayos homogéneos o, con menos frecuencia, inmunoensayos sin separación.
El uso de un calibrador se emplea a menudo en inmunoensayos. Los calibradores son soluciones que se sabe que contienen el analito en cuestión y la concentración de ese analito se conoce generalmente. La comparación de la respuesta de un ensayo a una muestra real con la respuesta del ensayo producida por los calibradores permite interpretar la intensidad de la señal en términos de la presencia o concentración del analito en la muestra.
Los inmunoensayos se basan en la capacidad de un anticuerpo para reconocer y unirse a una macromolécula específica en lo que podría ser una mezcla compleja de macromoléculas. En inmunología, la macromolécula particular unida por un anticuerpo se denomina antígeno y el área de un antígeno a la que se une el anticuerpo se denomina epítopo .
En algunos casos, un inmunoensayo puede utilizar un antígeno para detectar la presencia de anticuerpos, que reconocen ese antígeno, en una solución. En otras palabras, en algunos inmunoensayos, el analito puede ser un anticuerpo en lugar de un antígeno.
Además de la unión de un anticuerpo a su antígeno, la otra característica clave de todos los inmunoensayos es un medio para producir una señal mensurable en respuesta a la unión. La mayoría de los inmunoensayos, aunque no todos, implican la unión química de anticuerpos o antígenos con algún tipo de etiqueta detectable. En los inmunoensayos modernos existe una gran cantidad de etiquetas que permiten la detección por diferentes medios. Muchas etiquetas son detectables porque emiten radiación, producen un cambio de color en una solución, fluorescen bajo la luz o pueden inducirse a emitir luz.
A Rosalyn Sussman Yalow y Solomon Berson se les atribuye el desarrollo de los primeros inmunoensayos en la década de 1950. Yalow aceptó el Premio Nobel por su trabajo en inmunoensayos en 1977, convirtiéndose en la segunda mujer estadounidense en ganar el premio. [2]
Los inmunoensayos se volvieron considerablemente más sencillos de realizar y más populares cuando a finales de los años 1960 se demostraron las técnicas de enzimas unidas químicamente a anticuerpos. [3]
En 1983, el profesor Anthony Campbell [4] de la Universidad de Cardiff reemplazó el yodo radiactivo utilizado en inmunoensayos por un éster de acridinio que produce su propia luz: la quimioluminiscencia . Este tipo de inmunoensayo se utiliza actualmente en alrededor de 100 millones de pruebas clínicas cada año en todo el mundo, lo que permite a los médicos medir una amplia gama de proteínas, patógenos y otras moléculas en muestras de sangre. [5]
En 2012, la industria comercial de inmunoensayos ganaba 17.000.000.000 de dólares y se pensaba que tenía perspectivas de un lento crecimiento anual del orden del 2 al 3 por ciento. [6]
Los inmunoensayos emplean una variedad de etiquetas diferentes para permitir la detección de anticuerpos y antígenos. Los marcadores suelen estar unidos químicamente o conjugados con el anticuerpo o antígeno deseado.
Posiblemente una de las etiquetas más populares para usar en inmunoensayos sea la de enzimas . Los inmunoensayos que emplean enzimas se denominan inmunoensayos enzimáticos (EIA), de los cuales los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y la técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT) son los tipos más comunes.
Las enzimas utilizadas en los ELISA incluyen la peroxidasa de rábano picante (HRP), la fosfatasa alcalina (AP) o la glucosa oxidasa . Estas enzimas permiten la detección con frecuencia porque producen un cambio de color observable en presencia de ciertos reactivos. En algunos casos, estas enzimas están expuestas a reactivos que les hacen producir luz o quimioluminiscencia. Existen varios tipos de ELISA: directo, indirecto, sándwich, competitivo. [7]
Se pueden incorporar isótopos radiactivos a reactivos de inmunoensayo para producir un radioinmunoensayo (RIA). La radiactividad emitida por los complejos anticuerpo-antígeno unidos se puede detectar fácilmente utilizando métodos convencionales.
Los RIA fueron algunos de los primeros inmunoensayos desarrollados, pero han caído en desgracia en gran parte debido a la dificultad y los peligros potenciales que presenta trabajar con radiactividad. [8] [9]
Un enfoque más nuevo para los inmunoensayos implica combinar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR) y técnicas de inmunoensayo tradicionales. La etiqueta utilizada en estos ensayos, denominada PCR inmunocuantitativa en tiempo real (iqPCR), es una sonda de ADN . [10] [11]
Los reporteros fluorogénicos como la ficoeritrina se utilizan en varios inmunoensayos modernos. [12] Los microarrays de proteínas son un tipo de inmunoensayo que a menudo emplea reporteros fluorogénicos. [13]
Algunas etiquetas funcionan mediante electroquimioluminiscencia (ECL), en la que la etiqueta emite luz detectable en respuesta a una corriente eléctrica. [14] [15]
Si bien generalmente se emplea algún tipo de marcador en los inmunoensayos, existen ciertos tipos de ensayos que no se basan en marcadores, sino que emplean métodos de detección que no requieren la modificación o el etiquetado de los componentes del ensayo. La resonancia de plasmón superficial es un ejemplo de técnica que puede detectar la unión entre un anticuerpo no marcado y antígenos. [16] Otro inmunoensayo sin etiquetas demostrado implica medir el cambio en la resistencia de un electrodo a medida que los antígenos se unen a él. [17]
Los inmunoensayos se pueden ejecutar en varios formatos diferentes. Generalmente, un inmunoensayo se clasificará en una de varias categorías según cómo se realice. [18]
En un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. Luego se mide la cantidad de analito no unido marcado. En teoría, cuanto más analito hay en la muestra, más analito marcado se desplaza y luego se mide; por lo tanto, la cantidad de analito no unido marcado es proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
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Como en un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. En los ensayos heterogéneos, el analito marcado no unido se separa o se lava y el analito marcado restante se mide.
El analito desconocido en la muestra se une a los anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados y no unidos se eliminan por lavado y se miden los anticuerpos marcados y unidos. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de analito desconocido.
El analito de la muestra desconocida se une al sitio del anticuerpo y luego el anticuerpo marcado se une al analito. Luego se mide la cantidad de anticuerpo marcado en el sitio. Será directamente proporcional a la concentración del analito porque el anticuerpo marcado no se unirá si el analito no está presente en la muestra desconocida. Este tipo de inmunoensayo también se conoce como ensayo sándwich, ya que el analito se "intercala" entre dos anticuerpos.
Una amplia gama de pruebas médicas son inmunoensayos, denominados en este contexto inmunodiagnósticos. Muchas pruebas de embarazo caseras son inmunoensayos que detectan el marcador de embarazo gonadotropina coriónica humana . [20] Más específicamente, son pruebas cualitativas que detectan si hay hCG presente, utilizando una configuración de flujo lateral . [21] La prueba rápida de antígeno COVID-19 también es una prueba cualitativa de flujo lateral. [22]
Otros inmunoensayos clínicos son cuantitativos; miden cantidades. Los inmunoensayos pueden medir los niveles de CK-MB para evaluar enfermedades cardíacas, insulina para evaluar la hipoglucemia , antígeno prostático específico para detectar el cáncer de próstata y algunos también se utilizan para la detección y/o medición cuantitativa de algunos compuestos farmacéuticos (ver Técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas). para más detalles). [23]
Las pruebas de detección de drogas también comienzan con un inmunoensayo cualitativo rápido. [24]
Los inmunoensayos se utilizan en los laboratorios antidopaje deportivos para analizar muestras de sangre de los atletas en busca de hormona de crecimiento humana recombinante prohibida (rhGH, rGH, hGH, GH). [25]
El inmunoensayo fotoacústico mide señales acústicas de baja frecuencia generadas por etiquetas de nanopartículas metálicas . Iluminadas por una luz modulada en una longitud de onda de resonancia de plasmón, las nanopartículas generan una fuerte señal acústica, que puede medirse con un micrófono. [26] El inmunoensayo fotoacústico se puede aplicar a pruebas de flujo lateral, que utilizan nanopartículas coloidales. [27]
"El manual de inmunoensayo", tercera edición, David Wild, Ed., Elsevier, 2008