La obtención de imágenes químicas (como mapeo químico cuantitativo ) es la capacidad analítica para crear una imagen visual de la distribución de componentes a partir de la medición simultánea de espectros e información espacial y temporal. [1] [2] La obtención de imágenes hiperespectrales mide bandas espectrales contiguas, a diferencia de la obtención de imágenes multiespectrales que miden bandas espectrales espaciadas. [3]
La idea principal es que, para la obtención de imágenes químicas, el analista puede optar por tomar tantos espectros de datos medidos en un componente químico particular en una ubicación espacial en el tiempo; esto es útil para la identificación y cuantificación química. Alternativamente, la selección de un plano de imagen en un espectro de datos particular ( PCA , datos multivariables de longitud de onda, ubicación espacial en el tiempo) puede representar la distribución espacial de los componentes de la muestra, siempre que sus firmas espectrales sean diferentes en el espectro de datos seleccionado.
El software para imágenes químicas es más específico y se distingue de los métodos químicos como la quimiometría .
La instrumentación de imágenes tiene tres componentes: una fuente de radiación para iluminar la muestra, un elemento espectralmente selectivo y, por lo general, un conjunto de detectores (la cámara) para recopilar las imágenes. El formato de los datos se denomina hipercubo . El conjunto de datos se puede visualizar como un cubo de datos , un bloque tridimensional de datos que abarca dos dimensiones espaciales (x e y), con una serie de longitudes de onda (lambda) que conforman el tercer eje (espectral). El hipercubo se puede tratar visual y matemáticamente como una serie de imágenes con resolución espectral (cada plano de la imagen corresponde a la imagen en una longitud de onda) o una serie de espectros con resolución espacial.
Los sistemas de obtención de imágenes químicas en laboratorio que se comercializaron surgieron a principios de los años 1990 (ref. 1-5). Además de los factores económicos, como la necesidad de electrónica sofisticada y computadoras de gama extremadamente alta, una barrera importante para la comercialización de las imágenes infrarrojas era que el conjunto de plano focal (FPA) necesario para leer las imágenes infrarrojas no estaba fácilmente disponible como artículo comercial. A medida que la electrónica de alta velocidad y las computadoras sofisticadas se volvieron más comunes y las cámaras infrarrojas se volvieron fácilmente disponibles comercialmente, se introdujeron los sistemas de obtención de imágenes químicas en laboratorio.
Inicialmente utilizada para investigaciones novedosas en laboratorios especializados, la obtención de imágenes químicas se convirtió en una técnica analítica más común utilizada para I+D general, garantía de calidad (QA) y control de calidad (QC) en menos de una década. La rápida aceptación de la tecnología en una variedad de industrias (farmacéutica, polímeros, semiconductores, seguridad, ciencia forense y agricultura) se basa en la riqueza de información que caracteriza tanto la composición química como la morfología. La naturaleza paralela de los datos de obtención de imágenes químicas permite analizar múltiples muestras simultáneamente para aplicaciones que requieren un análisis de alto rendimiento además de caracterizar una sola muestra.
Las imágenes hiperespectrales se aplican con mayor frecuencia a muestras sólidas o en gel, y tienen aplicaciones en química, biología, [4] [5] [6] [7] [8] [9] medicina, [10] [11] farmacia [12] [13] (ver también, por ejemplo: ciencia de los alimentos, biotecnología, [14] [15] agricultura e industria. Las imágenes químicas NIR, IR y Raman también se conocen como imágenes hiperespectrales , espectroscópicas, espectrales o multiespectrales (ver también microespectroscopia ). Sin embargo, también se utilizan otras técnicas de imágenes ultrasensibles y selectivas que involucran microespectroscopia UV-visible o de fluorescencia. Muchas técnicas de imágenes se pueden utilizar para analizar muestras de todos los tamaños, desde la molécula única [16] [17] hasta el nivel celular en biología y medicina, [10] [18] [19] y para imágenes de sistemas planetarios en astronomía, pero se emplean diferentes instrumentos para hacer observaciones en sistemas tan diferentes.
Cualquier material que dependa de gradientes químicos para su funcionalidad puede ser susceptible de estudio mediante una técnica analítica que combine la caracterización espacial y química. Para diseñar y fabricar de forma eficiente y eficaz dichos materiales, se deben medir tanto el "qué" como el "dónde". La demanda de este tipo de análisis está aumentando a medida que los materiales fabricados se vuelven más complejos. Las técnicas de obtención de imágenes químicas son fundamentales para comprender los productos fabricados modernos y, en algunos casos, son una técnica no destructiva, de modo que las muestras se conservan para realizar más pruebas.
Muchos materiales, tanto manufacturados como naturales, obtienen su funcionalidad de la distribución espacial de los componentes de la muestra. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas de liberación prolongada se pueden lograr utilizando un recubrimiento que actúa como una capa de barrera. La liberación del ingrediente activo está controlada por la presencia de esta barrera, y las imperfecciones en el recubrimiento, como las discontinuidades, pueden provocar una alteración del rendimiento. En la industria de los semiconductores, las irregularidades o contaminantes en las obleas de silicio o los microcircuitos impresos pueden provocar el fallo de estos componentes. La funcionalidad de los sistemas biológicos también depende de los gradientes químicos: una sola célula, un tejido e incluso órganos enteros funcionan debido a la disposición muy específica de los componentes. Se ha demostrado que incluso pequeños cambios en la composición y distribución química pueden ser un indicador temprano de enfermedad.
La obtención de imágenes químicas comparte los fundamentos de las técnicas espectroscópicas vibracionales, pero proporciona información adicional mediante la adquisición simultánea de espectros con resolución espacial. Combina las ventajas de la obtención de imágenes digitales con los atributos de las mediciones espectroscópicas. En pocas palabras, la espectroscopia vibracional mide la interacción de la luz con la materia. Los fotones que interactúan con una muestra son absorbidos o dispersados; los fotones de energía específica son absorbidos y el patrón de absorción proporciona información, o una huella digital, sobre las moléculas presentes en la muestra.
Por otra parte, en términos de configuración de observación, la obtención de imágenes químicas se puede realizar en uno de los siguientes modos: absorción (óptica) , emisión (fluorescencia), transmisión (óptica) o dispersión (Raman). Actualmente existe un consenso en que los modos de fluorescencia ( emisión ) y dispersión Raman son los más sensibles y potentes, pero también los más costosos.
En una medición de transmisión, la radiación pasa a través de una muestra y se mide mediante un detector colocado en el lado más alejado de la muestra. La energía transferida desde la radiación entrante a la(s) molécula(s) se puede calcular como la diferencia entre la cantidad de fotones que fueron emitidos por la fuente y la cantidad que se mide mediante el detector. En una medición de reflectancia difusa, se realiza la misma medición de diferencia de energía, pero la fuente y el detector están ubicados en el mismo lado de la muestra, y los fotones que se miden han resurgido del lado iluminado de la muestra en lugar de pasar a través de él. La energía se puede medir en una o varias longitudes de onda; cuando se realiza una serie de mediciones, la curva de respuesta se denomina espectro .
Un elemento clave en la adquisición de espectros es que la radiación debe seleccionarse de alguna manera en términos de energía, ya sea antes o después de interactuar con la muestra. La selección de la longitud de onda se puede lograr con un filtro fijo, un filtro ajustable, un espectrógrafo, un interferómetro u otros dispositivos. Para un enfoque de filtro fijo, no es eficiente recopilar una cantidad significativa de longitudes de onda, y generalmente se recopilan datos multiespectrales. La obtención de imágenes químicas con interferómetros requiere que se recopilen rangos espectrales completos y, por lo tanto, da como resultado datos hiperespectrales . Los filtros ajustables tienen la flexibilidad de proporcionar datos multiespectrales o hiperespectrales , según los requisitos analíticos.
Los espectros normalmente se miden con un espectrómetro de imágenes , basado en una matriz de plano focal .
Algunas palabras comunes en espectroscopia, microscopía óptica y fotografía se han adaptado o su alcance se ha modificado para su uso en imágenes químicas. Incluyen: resolución, campo de visión y aumento. Hay dos tipos de resolución en imágenes químicas. La resolución espectral se refiere a la capacidad de resolver pequeñas diferencias de energía; se aplica al eje espectral. La resolución espacial es la distancia mínima entre dos objetos que se requiere para que se detecten como objetos distintos. La resolución espacial está influenciada por el campo de visión , una medida física del tamaño del área sondeada por el análisis. En imágenes, el campo de visión es un producto del aumento y el número de píxeles en la matriz de detectores. El aumento es una relación del área física de la matriz de detectores dividida por el área del campo de visión de la muestra. Aumentos mayores para el mismo detector generan una imagen de un área más pequeña de la muestra.
La obtención de imágenes químicas se ha implementado para la espectroscopia de infrarrojo medio, infrarrojo cercano y Raman . Al igual que con sus contrapartes de espectroscopia en masa, cada técnica de obtención de imágenes tiene fortalezas y debilidades particulares y es la más adecuada para satisfacer diferentes necesidades.
La espectroscopia de infrarrojo medio (MIR) analiza las vibraciones moleculares fundamentales que surgen en el rango espectral de 2500 a 25 000 nm. Las implementaciones de imágenes comerciales en la región MIR emplean generadores de imágenes hiperespectrales o interferómetros infrarrojos por transformada de Fourier ( FT-IR ), según la aplicación. Las bandas de absorción MIR tienden a ser relativamente estrechas y bien resueltas; la interpretación espectral directa suele ser posible por parte de un espectroscopista experimentado. La espectroscopia MIR puede distinguir cambios sutiles en la química y la estructura, y a menudo se utiliza para la identificación de materiales desconocidos. Las absorciones en este rango espectral son relativamente fuertes; por esta razón, la presentación de la muestra es importante para limitar la cantidad de material que interactúa con la radiación entrante en la región MIR. Los datos se pueden recopilar en modo de reflectancia, transmisión o emisión. El agua es un absorbente muy fuerte de la radiación MIR y las muestras húmedas a menudo requieren procedimientos de muestreo avanzados (como la reflectancia total atenuada ). Los instrumentos comerciales incluyen el mapeo de puntos y líneas y la obtención de imágenes. También es posible obtener imágenes químicas en el infrarrojo medio con una resolución espacial a nivel nanométrico mediante espectroscopia infrarroja basada en microscopio de fuerza atómica (AFM-IR). Se pueden obtener imágenes hiperespectrales de todo el ancho de banda del infrarrojo medio en cuestión de segundos utilizando pulsos ultracortos de infrarrojo medio. [21]
Para conocer los tipos de microscopio MIR, consulte Microscopía#Microscopía infrarroja .
Las ventanas atmosféricas en el espectro infrarrojo también se utilizan para realizar imágenes químicas a distancia. En estas regiones espectrales, los gases atmosféricos (principalmente agua y CO 2 ) presentan una absorción baja y permiten la visualización infrarroja a distancias kilométricas. Las moléculas objetivo pueden entonces visualizarse utilizando los procesos de absorción/emisión selectivos descritos anteriormente. En la imagen se muestra un ejemplo de la obtención de imágenes químicas de una liberación simultánea de SF 6 y NH 3 .
La región analítica del infrarrojo cercano (NIR) abarca el rango de 780 nm a 2500 nm. Las bandas de absorción observadas en este rango espectral surgen de los armónicos y las bandas de combinación de vibraciones de estiramiento y flexión de OH, NH, CH y SH. La absorción es de uno a dos órdenes de magnitud menor en el NIR en comparación con el MIR; este fenómeno elimina la necesidad de una preparación extensa de la muestra. Se pueden analizar muestras gruesas y delgadas sin ninguna preparación de la muestra, es posible adquirir imágenes químicas NIR a través de algunos materiales de embalaje y la técnica se puede utilizar para examinar muestras hidratadas, dentro de ciertos límites. Las muestras intactas se pueden visualizar en transmitancia o reflectancia difusa.
Las formas de línea para las bandas de sobretonos y combinaciones tienden a ser mucho más amplias y superpuestas que para las bandas fundamentales observadas en el MIR. A menudo, se utilizan métodos multivariados para separar las firmas espectrales de los componentes de la muestra. La obtención de imágenes químicas NIR es particularmente útil para realizar análisis rápidos, reproducibles y no destructivos de materiales conocidos. [23] [24] Los instrumentos de obtención de imágenes NIR se basan típicamente en una cámara hiperespectral , un filtro sintonizable o un interferómetro FT-IR. Siempre se necesita una fuente de luz externa, como el sol (escaneos al aire libre, teledetección) o una lámpara halógena (laboratorio, mediciones industriales).
El rango espectral de las imágenes químicas por desplazamiento Raman abarca aproximadamente de 50 a 4.000 cm −1 ; el rango espectral real sobre el que se realiza una medición Raman particular es una función de la frecuencia de excitación del láser. El principio básico detrás de la espectroscopia Raman difiere del MIR y NIR en que el eje x del espectro Raman se mide como una función del desplazamiento de energía (en cm −1 ) en relación con la frecuencia del láser utilizado como fuente de radiación. Brevemente, el espectro Raman surge de la dispersión inelástica de los fotones incidentes, que requiere un cambio en la polarizabilidad con la vibración, a diferencia de la absorción infrarroja, que requiere un cambio en el momento dipolar con la vibración. El resultado final es una información espectral que es similar y en muchos casos complementaria a la MIR. El efecto Raman es débil: solo uno de cada 10 7 fotones incidentes en la muestra sufre dispersión Raman. Tanto los materiales orgánicos como los inorgánicos poseen un espectro Raman; Generalmente producen bandas nítidas que son químicamente específicas. La fluorescencia es un fenómeno competitivo y, según la muestra, puede abrumar la señal Raman, tanto para la espectroscopia en masa como para las implementaciones de imágenes.
La obtención de imágenes químicas Raman requiere poca o ninguna preparación de la muestra. Sin embargo, se puede utilizar el corte físico de la muestra para exponer la superficie de interés, teniendo cuidado de obtener una superficie lo más plana posible. Las condiciones requeridas para una medición particular dictan el nivel de invasividad de la técnica, y las muestras que son sensibles a la radiación láser de alta potencia pueden dañarse durante el análisis. Es relativamente insensible a la presencia de agua en la muestra y, por lo tanto, es útil para obtener imágenes de muestras que contienen agua, como material biológico.
La microespectroscopia de emisión es una técnica sensible con excitación y emisión que abarcan las regiones ultravioleta, visible y NIR. Como tal, tiene numerosas aplicaciones biomédicas, biotecnológicas y agrícolas. Existen varias técnicas de fluorescencia potentes, altamente específicas y sensibles que se utilizan actualmente o que aún se encuentran en desarrollo; entre las primeras se encuentran FLIM, FRAP, FRET y FLIM-FRET; entre las últimas se encuentran la fluorescencia NIR y las técnicas de microespectroscopia y nanoespectroscopia de fluorescencia NIR mejoradas por sensibilidad de sonda (consulte la sección "Lectura adicional"). La microespectroscopia de emisión de fluorescencia y la obtención de imágenes también se utilizan comúnmente para localizar cristales de proteínas [25] en solución, para la caracterización de metamateriales y dispositivos biotecnológicos.
El valor de la obtención de imágenes reside en la capacidad de resolver heterogeneidades espaciales en muestras en estado sólido o en gel/similares a gel. La obtención de imágenes de un líquido o incluso de una suspensión tiene un uso limitado, ya que el movimiento constante de la muestra sirve para promediar la información espacial, a menos que se empleen técnicas de registro ultrarrápido, como en la microespectroscopia de correlación de fluorescencia o las observaciones FLIM, en las que se puede controlar una sola molécula a una velocidad de detección (fotónica) extremadamente alta. Sin embargo, los experimentos de alto rendimiento (como la obtención de imágenes de placas multipocillo) de muestras líquidas pueden proporcionar información valiosa. En este caso, se puede utilizar la adquisición paralela de miles de espectros para comparar las diferencias entre muestras, en lugar de la implementación más común de explorar la heterogeneidad espacial dentro de una sola muestra.
De manera similar, no hay beneficio en obtener imágenes de una muestra verdaderamente homogénea, ya que un espectrómetro de punto único generará la misma información espectral. Por supuesto, la definición de homogeneidad depende de la resolución espacial del sistema de obtención de imágenes empleado. Para la obtención de imágenes MIR, donde las longitudes de onda abarcan de 3 a 10 micrómetros, teóricamente se pueden resolver objetos del orden de 5 micrómetros. Las áreas muestreadas están limitadas por las implementaciones experimentales actuales porque la iluminación la proporciona el interferómetro. La obtención de imágenes Raman puede ser capaz de resolver partículas de menos de 1 micrómetro de tamaño, pero el área de muestra que se puede iluminar es severamente limitada. Con la obtención de imágenes Raman, se considera poco práctico obtener imágenes de áreas grandes y, en consecuencia, de muestras grandes. La obtención de imágenes químicas/hiperespectrales FT-NIR generalmente resuelve solo objetos más grandes (>10 micrómetros) y es más adecuada para muestras grandes porque las fuentes de iluminación están fácilmente disponibles. Sin embargo, recientemente se informó que la microespectroscopia FT-NIR es capaz de alcanzar una resolución de aproximadamente 1,2 micrones (micrómetros) en muestras biológicas [10]. Además, se informó que los experimentos FCS de excitación de dos fotones alcanzaron una resolución de 15 nanómetros en películas delgadas de biomembrana con una configuración especial de conteo de fotones de coincidencia.
El concepto de límite de detección para la obtención de imágenes químicas es bastante diferente al de la espectroscopia en masa, ya que depende de la muestra en sí. Debido a que un espectro en masa representa un promedio de los materiales presentes, las firmas espectrales de los componentes traza simplemente se ven superadas por la dilución. Sin embargo, en la obtención de imágenes, cada píxel tiene un espectro correspondiente. Si el tamaño físico del contaminante traza es del orden del tamaño del píxel representado en la imagen de la muestra, su firma espectral probablemente será detectable. Sin embargo, si el componente traza se dispersa de manera homogénea (en relación con el tamaño de la imagen del píxel) en toda la muestra, no será detectable. Por lo tanto, los límites de detección de las técnicas de obtención de imágenes químicas están fuertemente influenciados por el tamaño de las partículas, la heterogeneidad química y espacial de la muestra y la resolución espacial de la imagen.
Los métodos de análisis de datos para conjuntos de datos de imágenes químicas suelen emplear algoritmos matemáticos comunes a la espectroscopia de punto único o al análisis de imágenes. El razonamiento es que el espectro adquirido por cada detector es equivalente a un espectro de punto único; por lo tanto, se utilizan técnicas de preprocesamiento, quimiometría y reconocimiento de patrones con el objetivo similar de separar los efectos químicos y físicos y realizar una caracterización cualitativa o cuantitativa de los componentes individuales de la muestra. En la dimensión espacial, cada imagen química es equivalente a una imagen digital y se puede utilizar un análisis de imagen estándar y un análisis estadístico sólido para la extracción de características.
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