Un experimento de una sola molécula es un experimento que investiga las propiedades de moléculas individuales . Los estudios de una sola molécula pueden contrastarse con las mediciones de un conjunto o colección masiva de moléculas, donde no se puede distinguir el comportamiento individual de las moléculas y sólo se pueden medir las características promedio . Dado que muchas técnicas de medición en biología, química y física no son lo suficientemente sensibles para observar moléculas individuales, las técnicas de fluorescencia de moléculas individuales (que han surgido desde la década de 1990 para investigar diversos procesos a nivel de moléculas individuales) causaron mucho entusiasmo, ya que Estos proporcionaron muchos detalles nuevos sobre los procesos medidos que no eran accesibles en el pasado. De hecho, desde la década de 1990 se han desarrollado muchas técnicas para sondear moléculas individuales. [2]
Los primeros experimentos con una sola molécula fueron experimentos de abrazadera de parche realizados en la década de 1970, pero se limitaron al estudio de los canales iónicos . Hoy en día, los sistemas investigados utilizando técnicas de molécula única incluyen el movimiento de la miosina en los filamentos de actina en el tejido muscular y los detalles espectroscópicos de entornos locales individuales en sólidos. Las conformaciones de los polímeros biológicos se han medido mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Usando espectroscopía de fuerza , se pueden estirar mecánicamente moléculas individuales (o pares de moléculas que interactúan), generalmente polímeros , y registrar su respuesta elástica en tiempo real.
En la fase gaseosa a presiones ultrabajas se realizan experimentos con una sola molécula desde hace décadas, pero en la fase condensada recién desde 1989 con el trabajo de WE Moerner y Lothar Kador. [3] Un año más tarde, Michel Orrit y Jacky Bernard pudieron demostrar también la detección de la absorción de moléculas individuales mediante su fluorescencia. [4]
Muchas técnicas tienen la capacidad de observar una molécula a la vez, sobre todo la espectrometría de masas , donde se detectan iones individuales. Además, uno de los primeros medios para detectar moléculas individuales surgió en el campo de los canales iónicos con el desarrollo de la técnica de abrazadera de parche por parte de Erwin Neher y Bert Sakmann (quienes más tarde ganarían el premio Nobel por sus contribuciones fundamentales). . Sin embargo, la idea de medir la conductancia para observar moléculas individuales imponía una seria limitación al tipo de sistemas que podían observarse.
La fluorescencia es un medio conveniente para observar una molécula a la vez, principalmente debido a la sensibilidad de los detectores ópticos comerciales, capaces de contar fotones individuales. Sin embargo, espectroscópicamente, la observación de una molécula requiere que la molécula esté en un ambiente aislado y que emita fotones al ser excitada, lo que debido a la tecnología para detectar fotones individuales mediante el uso de tubos fotomultiplicadores (PMT) o fotodiodos de avalancha (APD), permite registrar eventos de emisión de fotones con gran sensibilidad y resolución temporal.
Más recientemente, la fluorescencia de una sola molécula es objeto de intenso interés para la obtención de imágenes biológicas, a través del etiquetado de biomoléculas como proteínas y nucleótidos para estudiar la función enzimática que no se puede estudiar fácilmente a gran escala, debido a movimientos sutiles dependientes del tiempo en la catálisis. y reorganización estructural. La proteína más estudiada ha sido la clase de enzimas miosina/actina que se encuentran en los tejidos musculares. Mediante técnicas de molécula única se ha observado y caracterizado el mecanismo escalonado en muchas de estas proteínas.
En 1997, Katrin Kneipp , H. Kneipp, Y. Wang, LT Perelman y otros [5] demostraron la detección de una sola molécula mediante espectroscopia Raman de superficie mejorada (SERS) en el MIT e independientemente por S. Nie y SR Emory en Indiana. Universidad . [6] El equipo del MIT utilizó excitación Raman sin resonancia y mejora de la superficie con nanoclusters de plata para detectar moléculas individuales de violeta de cresilo , mientras que el equipo de la Universidad de Indiana utilizó excitación Raman por resonancia y mejora de la superficie con nanopartículas de plata para detectar moléculas individuales de rodamina 6G .
Los nanomanipuladores como el microscopio de fuerza atómica también son adecuados para experimentos de importancia biológica con una sola molécula, ya que funcionan en la misma escala de longitud que la mayoría de los polímeros biológicos. Además, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es apropiada para el estudio de moléculas de polímeros sintéticos. AFM ofrece una posibilidad única de visualización 3D de cadenas de polímeros. Por ejemplo, el modo de golpeteo AFM es lo suficientemente suave para el registro de moléculas de polielectrolito adsorbidas (por ejemplo, cadenas de poli(2-vinilpiridina) de 0,4 nm de espesor) en un medio líquido. La ubicación de la superposición de dos cadenas corresponde en estos experimentos al doble del espesor de una sola cadena (0,8 nm en el caso del ejemplo mencionado). Cuando se aplican los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de dichas moléculas permanece sin cambios durante horas, lo que permite realizar experimentos en medios líquidos que tienen diversas propiedades. [1] Además, controlando la fuerza entre la punta y la muestra se pueden obtener imágenes de alta resolución. [7] [8] También se han utilizado pinzas ópticas para estudiar y cuantificar las interacciones ADN-proteína. [7] [8]
La espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula utiliza la fluorescencia de una molécula para obtener información sobre su entorno, estructura y posición. La técnica permite obtener información que de otro modo no estaría disponible debido al promedio conjunto (es decir, una señal obtenida al registrar muchas moléculas al mismo tiempo representa una propiedad promedio de la dinámica de las moléculas). Los resultados en muchos experimentos de moléculas individuales son trayectorias de dos estados .
Como en el caso de la espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula, la técnica conocida como grabación de un solo canal se puede utilizar para obtener información cinética específica (en este caso, sobre la función del canal iónico) que no está disponible cuando se realiza la grabación en conjunto, como la grabación de células completas. realizado. [9] Específicamente, los canales iónicos alternan entre clases conductoras y no conductoras, que difieren en su conformación. Por lo tanto, el estado funcional de los canales iónicos se puede medir directamente con dispositivos electrónicos suficientemente sensibles, siempre que se tomen las precauciones adecuadas para minimizar el ruido. A su vez, cada una de estas clases se puede dividir en uno o más estados cinéticos que influyen directamente en la función subyacente del canal iónico. La realización de estos tipos de estudios de molécula única en condiciones que varían sistemáticamente (por ejemplo, concentración y estructura del agonista, ion permeante y/o bloqueador del canal, mutaciones en los aminoácidos del canal iónico) puede proporcionar información sobre la interconversión de diversos estados cinéticos del canal iónico. [10] En un modelo mínimo para un canal iónico, hay dos estados : abierto y cerrado. Sin embargo, a menudo se necesitan otros estados para representar con precisión los datos, incluidos múltiples estados cerrados, así como estados inactivos y/o desensibilizados, que son estados no conductores que pueden ocurrir incluso en presencia de estímulo. [9]
Los fluoróforos individuales se pueden unir químicamente a biomoléculas, como proteínas o ADN, y la dinámica de las moléculas individuales se puede rastrear mediante el monitoreo de la sonda fluorescente. Se pueden rastrear los movimientos espaciales dentro del límite de Rayleigh , junto con los cambios en la intensidad de las emisiones y/o la vida radiativa, que a menudo indican cambios en el entorno local. Por ejemplo, el etiquetado de una sola molécula ha proporcionado una gran cantidad de información sobre cómo las proteínas motoras cinesinas se mueven a lo largo de las hebras de microtúbulos en las células musculares. Las imágenes de una sola molécula en células vivas revelan información interesante sobre la dinámica de las proteínas en su entorno fisiológico. Se pueden cuantificar varios parámetros biofísicos sobre la dinámica de las proteínas, como el coeficiente de difusión, los desplazamientos cuadráticos medios, el tiempo de residencia, la fracción de moléculas unidas y no unidas y el mecanismo de búsqueda de objetivos de unión de proteínas a su sitio objetivo en la célula viva. [11]
Artículo principal smFRET .
En la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de una sola molécula , la molécula está marcada en (al menos) dos lugares. Se enfoca un rayo láser sobre la molécula que excita la primera sonda. Cuando esta sonda se relaja y emite un fotón, tiene posibilidades de excitar la otra sonda. La eficacia de la absorción del fotón emitido por la primera sonda en la segunda sonda depende de la distancia entre estas sondas. Dado que la distancia cambia con el tiempo, este experimento prueba la dinámica interna de la molécula.
Cuando se analizan datos relacionados con moléculas individuales, normalmente se pueden construir propagadores y funciones de densidad de probabilidad de tiempo de salto de primer orden, segundo orden, etc., mientras que a partir de experimentos en masa se suele obtener la caída de una función de correlación. [12] A partir de la información contenida en estas funciones únicas (obtenidas de moléculas individuales), se puede extraer una imagen relativamente clara sobre la forma en que se comporta el sistema; por ejemplo, su esquema cinético , o su potencial de actividad, o su forma de dimensiones reducidas . [13] [14] En particular, se pueden construir (muchas propiedades de) la vía de reacción de una enzima cuando se monitorea la actividad de una enzima individual. [15] Además, varios autores han descrito aspectos importantes relacionados con el análisis de datos de una sola molécula, como métodos de ajuste y pruebas para poblaciones homogéneas. [9] Por otro lado, existen varios problemas con el análisis de datos de una sola molécula, incluida la construcción de un entorno de bajo ruido y puntas de pipeta aisladas, el filtrado de algunos de los componentes restantes no deseados (ruido) que se encuentran en las grabaciones y el período de tiempo. requerido para el análisis de datos (preprocesamiento, detección inequívoca de eventos, trazado de datos, ajuste de esquemas cinéticos, etc.).
Las técnicas de una sola molécula impactaron la óptica, la electrónica, la biología y la química. En las ciencias biológicas, el estudio de las proteínas y otros mecanismos biológicos complejos se limitaba a experimentos conjuntos que hacían casi imposible la observación directa de su cinética. Por ejemplo, fue sólo después de que se utilizó la microscopía de fluorescencia de una sola molécula para estudiar los pares de cinesina-miosina en el tejido muscular que se entendió la observación directa de los mecanismos de la marcha. Sin embargo, estos experimentos se han limitado en su mayor parte a estudios in vitro, ya que aún no se han desarrollado plenamente técnicas útiles para la obtención de imágenes de células vivas. Sin embargo , la promesa de imágenes in vivo de una sola molécula [16] trae consigo un enorme potencial para observar directamente biomoléculas en procesos nativos. Estas técnicas suelen ser el objetivo de estudios que involucran proteínas de baja copia, muchas de las cuales aún están por descubrirse. Estas técnicas también se han extendido al estudio de áreas de la química, incluido el mapeo de superficies heterogéneas. [17]