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Imágenes de calcio

La obtención de imágenes de calcio es una técnica de microscopía para medir ópticamente el estado del calcio (Ca 2+ ) de una célula , tejido o medio aislado. Las imágenes de calcio aprovechan los indicadores de calcio, moléculas fluorescentes que responden a la unión de iones Ca 2+ mediante propiedades de fluorescencia. Existen dos clases principales de indicadores de calcio: indicadores químicos e indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). [1] Esta técnica ha permitido estudios de la señalización del calcio en una amplia variedad de tipos de células. En las neuronas, la generación del potencial de acción siempre va acompañada de una rápida entrada de iones Ca 2+ . Por lo tanto, las imágenes de calcio se pueden utilizar para monitorear la actividad eléctrica en cientos de neuronas en cultivos celulares o en animales vivos, lo que ha hecho posible observar la actividad de los circuitos neuronales durante el comportamiento en curso. [2]

Indicadores químicos

Esquema de una configuración típica para imágenes de fluorescencia de calcio de miocitos cardíacos aislados

Los indicadores químicos son pequeñas moléculas que pueden quelar iones de calcio. Todas estas moléculas se basan en un homólogo de EGTA llamado BAPTA , con alta selectividad por los iones de calcio (Ca 2+ ) frente a los iones de magnesio (Mg 2+ ).

Este grupo de indicadores incluye fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 , Calcium Green-1.

Estos colorantes se utilizan a menudo con los grupos carboxilo quelantes enmascarados como ésteres de acetoximetilo , para hacer que la molécula sea lipófila y permitir una fácil entrada a la célula. Una vez que esta forma del indicador esté en la célula, las esterasas celulares liberarán los grupos carboxilo y el indicador podrá unirse al calcio. La forma de ácido libre de los colorantes (es decir, sin la modificación del éster acetoximetílico) también se puede inyectar directamente en las células mediante un microelectrodo o micropipeta , lo que elimina incertidumbres en cuanto al compartimento celular que contiene el colorante (el éster acetoximetílico también puede ingresar al retículo endoplásmico y a las mitocondrias) . ). La unión de un ion Ca 2+ a una molécula indicadora fluorescente conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de la fluorescencia o a un cambio en la longitud de onda de emisión/excitación . Los indicadores químicos fluorescentes de Ca 2+ individuales se utilizan para mediciones de calcio citosólico en una amplia variedad de preparaciones celulares. La primera imagen de Ca 2+ en tiempo real (velocidad de vídeo) se llevó a cabo en 1986 en células cardíacas utilizando cámaras de vídeo intensificadas. [3] El desarrollo posterior de la técnica utilizando microscopios confocales de barrido láser reveló señales de Ca 2+ subcelulares en forma de chispas de Ca 2+ y destellos de Ca 2+ . También se utilizaron respuestas relativas de una combinación de indicadores químicos fluorescentes de Ca 2+ para cuantificar los transitorios de calcio en orgánulos intracelulares como las mitocondrias . [4]

Las imágenes de calcio, también conocidas como mapeo de calcio, también se utilizan para realizar investigaciones sobre el tejido miocárdico. [5] El mapeo de calcio es una técnica ubicua que se utiliza en corazones completos y aislados, como especies de ratones, ratas y conejos.

Indicadores de calcio codificados genéticamente.

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) son herramientas poderosas útiles para obtener imágenes in vivo de procesos celulares, de desarrollo y fisiológicos. [6] [7] [8] [9] Los GECI no necesitan cargarse de forma precisa en las células; en cambio, los genes que codifican estas proteínas pueden introducirse en células o líneas celulares individuales mediante diversos métodos de transfección . También es posible crear animales transgénicos que expresen el indicador en todas las células o selectivamente en ciertos subtipos celulares. Los GECI se utilizan para estudiar neuronas, [10] [11] células T , [12] cardiomiocitos , [13] y otros tipos de células. Algunos GECI informan sobre el calcio mediante emisión directa de fotones ( luminiscencia ), pero la mayoría se basa en proteínas fluorescentes como informantes, incluida la proteína verde fluorescente GFP y sus variantes (eGFP, YFP, CFP).

De los indicadores fluorescentes, los sistemas indicadores de calcio se pueden clasificar en sistemas de proteínas fluorescentes únicas (FP) y sistemas de proteínas fluorescentes pareadas. Los camgaroos fueron una de las primeras variantes desarrolladas que involucraban un único sistema proteico. Los camgaroos aprovechan la calmodulina (CaM), una proteína fijadora de calcio. En estas estructuras, CaM se inserta en medio de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en Y145. Estudios de mutagénesis anteriores revelaron que las mutaciones en esta posición conferían estabilidad del pH al tiempo que mantenían las propiedades fluorescentes, lo que convertía a Y145 en un punto de inserción de interés. Además, los extremos N y C de YFP están unidos por un conector peptídico (GGTGGS). Cuando CaM se une a Ca2+, el pKa efectivo disminuye, lo que permite la desprotonación del cromóforo. [14] Esto da como resultado un aumento de la fluorescencia tras la unión del calcio de forma tensiométrica. Esta detección contrasta con los sistemas ratiométricos, en los que hay un cambio en los espectros de absorbancia/emisión como resultado de la unión de Ca2+. [15] Un sistema de FP único desarrollado posteriormente, denominado G-CaMP , también invoca GFP permutada circularmente. Uno de los extremos está fusionado con CaM y el otro está fusionado con M13 (el dominio de unión a calmodulina de la miosina quinasa ligera) [16] La proteína está diseñada de tal manera que los extremos están cerca en el espacio, lo que permite que la unión de Ca2+ cause conformacional. cambios y modulación del cromóforo, lo que permite una mayor fluorescencia. G-CaMP y sus variantes refinadas tienen afinidades de unión nanomolares. [17] Una última variante de proteína única es CatchER, que generalmente se considera un indicador de menor afinidad. Su bolsillo de unión al calcio es bastante negativo; La unión del catión ayuda a proteger la gran concentración de carga negativa y permite recuperar la fluorescencia. [18]

En contraste con estos sistemas, existen sistemas de proteínas fluorescentes emparejados, que incluyen los Cameleons prototípicos . Los cameleons constan de dos proteínas fluorescentes diferentes, CaM, M13 y un conector de glicilglicina. [15] En ausencia de Ca2+, sólo la proteína fluorescente desplazada hacia el azul del donante será fluorescente. Sin embargo, un cambio conformacional causado por la unión del calcio reposiciona la proteína fluorescente desplazada al rojo, lo que permite que se produzca FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster). Los indicadores Cameleon producen una señal ratiométrica (es decir, la eficiencia FRET medida depende de la concentración de calcio). Las variantes originales de cameleons eran originalmente más sensibles al Ca2+ y se apagaban con ácido. [19] Estas deficiencias fueron anuladas por las mutaciones Q69K y V68L. Ambos residuos estaban cerca del cromóforo aniónico enterrado y estas mutaciones probablemente dificultan la protonación, confiriendo una mayor resistencia al pH.

De creciente importancia en la detección de calcio son los GECI de infrarrojo cercano (NIR), que pueden abrir vías para multiplexar diferentes sistemas indicadores y permitir una penetración más profunda en el tejido. Los NIR dependen de proteínas fluorescentes que se unen a biliverdina, que se derivan en gran medida de fitocromos bacterianos . Los sistemas NIR son similares a las pericams inversas en que ambos experimentan una disminución de la fluorescencia tras la unión de Ca2+. Los RCaMP y RGECO funcionan a más de 700 nm, pero son bastante tenues. [20] También se ha construido con éxito un análogo de Cameleon que involucra NIR FRET. [21]

Una clase especial de GECI está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable Eos , que cambia de verde a rojo mediante la escisión de la columna vertebral fotocatalizada (con luz violeta). [22] Combinada con la CaM, la luz violeta fotoconvierte solo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a sinapsis. [23]

Si bien los sistemas fluorescentes se utilizan ampliamente, los indicadores bioluminiscentes de Ca2+ también pueden tener potencial debido a su capacidad para anular la autofluorescencia, el fotoblanqueo [no se necesita longitud de onda de excitación], la degradación biológica y la toxicidad, además de relaciones señal-ruido más altas. [24] Dichos sistemas pueden depender de la aequorina y la luciferina coelenterazina. La unión de Ca2+ provoca un cambio conformacional que facilita la oxidación de la coelenterazina. El fotoproducto resultante emite luz azul a medida que regresa al estado fundamental. La colocalización de aequorina con GFP facilita BRET/CRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia o quimioluminiscencia), [18] , lo que da como resultado un aumento de brillo de 19 a 65. Estas estructuras se pueden utilizar para sondear concentraciones de calcio de milimolares a nanomolares. Un sistema similar invoca obelina y su luciferina coelenteramida, que pueden poseer un tiempo de respuesta al calcio más rápido y una insensibilidad al Mg2+ que su contraparte aqueorina. [25] Estos sistemas también pueden aprovechar el autoensamblaje de los componentes de la luciferasa. En un sistema denominado "nano-linterna", la luciferasa RLuc8 se divide y se coloca en diferentes extremos de CaM. La unión del calcio acerca los componentes de RLuc8, reformando la luciferasa y permitiéndole transferirse a una proteína fluorescente aceptora.

Para minimizar el daño a las células visualizadas, a menudo se recurre a la microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia de los reporteros. [26] El uso de longitudes de onda de infrarrojo cercano y la minimización de la dispersión axial de la función puntual [27] permite una resolución nanométrica y una penetración profunda en el tejido. El rango dinámico suele determinarse a partir de estas mediciones. Para indicadores no radiométricos (normalmente indicadores de proteína única), es la relación de las intensidades de fluorescencia obtenidas en condiciones de saturación y empobrecimiento de Ca2+, respectivamente. Sin embargo, para los indicadores ratiométricos, el rango dinámico es la relación entre la relación de eficiencia máxima de FRET (saturada de calcio) y la relación de eficiencia mínima de FRET (agotada de calcio). Otra cantidad común utilizada para medir las señales producidas por los flujos de concentración de calcio es la relación señal-línea de base (SBR), que es simplemente la relación del cambio en la fluorescencia (F - F0) sobre la fluorescencia de referencia. Esto se puede relacionar con la SNR (relación señal-ruido) multiplicando la SBR por la raíz cuadrada del número de fotones contados. [18]

Una clase especial de indicadores de calcio codificados genéticamente está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en las neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable mEos , que cambia de verde a rojo cuando se ilumina con luz violeta. Combinada con el sensor de calcio calmodulina , la luz violeta fotoconvierte sólo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a sinapsis.

Uso

Independientemente del tipo de indicador utilizado, el procedimiento de obtención de imágenes suele ser muy similar. Las células cargadas con un indicador, o que lo expresan en el caso de un GECI, [42] pueden verse usando un microscopio de fluorescencia y capturarse con una cámara científica CMOS (sCMOS) [43] o una cámara CCD . Los microscopios confocales y de dos fotones proporcionan capacidad de corte óptico para que las señales de calcio puedan resolverse en microdominios como espinas dendríticas o botones sinápticos , incluso en muestras gruesas como cerebros de mamíferos. Las imágenes se analizan midiendo los cambios en la intensidad de la fluorescencia para una sola longitud de onda o dos longitudes de onda expresadas como una relación (indicadores radiométricos). Si es necesario, las intensidades y proporciones de fluorescencia derivadas se pueden representar gráficamente frente a valores calibrados para niveles conocidos de Ca 2+ para medir las concentraciones absolutas de Ca 2+ . Los métodos de microscopía de campo luminoso [44] amplían la lectura funcional de las capacidades de actividad neuronal en volúmenes 3D.

Métodos como la fotometría de fibra , [45] [46] miniscopios [47] y microscopía de dos fotones [48] [49] ofrecen imágenes de calcio en modelos animales que se comportan libremente y tienen la cabeza fija.

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