Los transposones son secuencias de ADN semiparasitarias que pueden replicarse y propagarse a través del genoma del huésped . Pueden utilizarse como herramienta genética para el análisis de la función de genes y proteínas . El uso de transposones está bien desarrollado en Drosophila (en la que los elementos P son los más utilizados) y en la berro de Thale ( Arabidopsis thaliana ) y en bacterias como Escherichia coli ( E. coli ). [1] [2]
En la actualidad, los transposones se pueden utilizar en la investigación genética y en la ingeniería genética recombinante para la mutagénesis insercional . La mutagénesis insercional es cuando los transposones funcionan como vectores para ayudar a eliminar e integrar secuencias genéticas. Dado su diseño relativamente simple y su capacidad inherente para mover secuencias de ADN, los transposones son altamente compatibles para la transducción de material genético, lo que los convierte en herramientas genéticas ideales.
La mutagénesis por marcado de firmas (también conocida como STM) es una técnica centrada en el uso de la inserción de elementos transponibles para determinar el fenotipo de un locus en el genoma de un organismo. Si bien las técnicas de secuenciación genética pueden determinar el genotipo de un genoma, no pueden determinar la función o la expresión fenotípica de las secuencias genéticas. [3] [4] La STM puede evitar este problema mutando un locus, lo que hace que forme un nuevo fenotipo; al comparar las expresiones fenotípicas observadas del locus mutado y el inalterado, se puede deducir la expresión fenotípica del locus.
En la STM, se insertan transposones especialmente marcados en un organismo, como una bacteria, y se integran aleatoriamente en el genoma del huésped. En teoría, el organismo mutante modificado debería expresar el gen alterado, alterando así el fenotipo. Si se observa un nuevo fenotipo, se secuencia el genoma y se buscan transposones marcados. [3] Si se encuentra el sitio de integración del transposón, entonces el locus puede ser responsable de la expresión de los fenotipos. [5] [6]
Se han realizado muchos estudios basados en transposones STM, más notablemente con los elementos P [4] en Drosophila . Los elementos P son transposones descritos originalmente en el genoma de Drosophila melanogaster capaces de ser sintetizados artificialmente o propagados a otras especies de Drosophila mediante transferencia horizontal. [4] En ensayos experimentales, los elementos P creados artificialmente y los genes de transposasa se insertan en los genomas de embriones de Drosophila . Posteriormente, los embriones que presentan mutaciones tienen sus genomas secuenciados y comparados, revelando así los loci que han sido afectados por la inserción y las funciones de los loci., [4] [6]
La inactivación insercional se centra en suprimir la expresión de un gen alterando su secuencia con una inserción. Cuando se insertan nucleótidos adicionales cerca o dentro de un locus, el locus puede sufrir una mutación por cambio de marco que podría impedir que se exprese correctamente en la cadena polipeptídica . La inactivación insercional basada en transposones se considera para la investigación médica, desde la supresión de la resistencia a los antibióticos en bacterias hasta el tratamiento de enfermedades genéticas . [7] En el tratamiento de enfermedades genéticas, la inserción de un transposón en un locus genético perjudicial del genoma del organismo desalinearía la secuencia del locus, truncando cualquier proteína dañina formada y volviéndola no funcional. Alternativamente, la inactivación insercional podría usarse para suprimir genes que expresan resistencia a los antibióticos en bacterias., [7] [8]
Aunque los transposones se han utilizado con éxito en plantas e invertebrados mediante mutagénesis insercional y activación insercional, el uso de transposones en vertebrados ha sido limitado debido a la falta de transposones específicos para vertebrados. Casi todos los transposones compatibles y presentes en los genomas de vertebrados están inactivos y a menudo se los relega al ADN "basura". [6] Sin embargo, es posible identificar transposones latentes y recrearlos artificialmente como agentes activos. [6] Los investigadores genéticos Zsuzsanna Izsvák y Zoltán Ivics descubrieron una secuencia de transposón de pez que, a pesar de haber estado latente durante 15 millones de años, podría resucitarse como un vector para introducir genes extraños en los genomas de vertebrados, incluidos los de los humanos. Este transposón, llamado La Bella Durmiente , fue descrito en 1997 y podría reactivarse artificialmente para convertirse en un transposón funcional. [6]
La Bella Durmiente también puede ser viable en procedimientos de terapia génica al ayudar a introducir transgenes beneficiosos en los genomas del huésped. Belcher et al. probaron esta noción utilizando transposones de la Bella Durmiente para ayudar a insertar secuencias en ratones con anemia de células falciformes para que pudieran producir las enzimas necesarias para contrarrestar su anemia. [6] Belcher et al. comenzaron su experimento construyendo una secuencia genética que consistía en el elemento transponible Hmox-1 y la transposasa de la Bella Durmiente. Luego, esta secuencia se agregó, se insertó en un plásmido y se introdujo en las células de los ratones. La transposasa de la Bella Durmiente ayudó a insertar el transposón Hmox-1 en el genoma de los ratones, lo que permitió la producción de la enzima hemooxigenasa-1 (HO-1). Los ratones que recibieron la inserción mostraron un aumento de cinco veces en la expresión de HO-1, lo que a su vez redujo el bloqueo de los vasos sanguíneos causado por la anemia de células falciformes. La publicación del experimento en 2010 mostró que los transposones pueden ser útiles en la terapia génica. [6]
Los elementos P que se encuentran en la naturaleza contienen:
La transposasa es una enzima que regula y cataliza la escisión de un elemento P del ADN del huésped, cortando en dos sitios de reconocimiento y luego reinsertando el elemento P aleatoriamente. Es el proceso de inserción aleatoria, que puede interferir con genes existentes o transportar un gen adicional, que puede usarse como un proceso para la investigación genética.
Para utilizar este proceso como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar una transposición incontrolada. Por lo tanto, las herramientas genéticas normales son:
Los plásmidos P siempre contienen:
y puede contener:
(Métodos de genética avanzada) Hay dos formas principales de utilizar estas herramientas: transformación de moscas y mutagénesis insercional, cada una descrita a continuación.
(esperando inserción en regiones no codificantes)
Es importante tener en cuenta que el gen insertado puede haber dañado la función de uno de los genes del huésped. Se requieren varias líneas de moscas para poder realizar la comparación y garantizar que no se hayan eliminado genes adicionales.
(esperando inserción en región codificante)
Posibles mutaciones:
El secuestro de un potenciador de otro gen permite el análisis de la función de ese potenciador. Esto, especialmente si el gen reportero es para una proteína fluorescente, se puede utilizar para ayudar a mapear la expresión del gen mutado a través del organismo y es una herramienta muy poderosa.
(Método de genética inversa)
Si hay un elemento P antiguo cerca del gen de interés (con una transposasa rota), se puede removilizar mediante microinyección del embrión con la codificación para la transposasa o la transposasa misma. El elemento P a menudo se transpondrá a unas pocas kilobases de la ubicación original, con lo que es de esperar que afecte al gen de interés como en el caso de la "mutagénesis por inserción".
Una vez determinada la función de la proteína mutada es posible secuenciar/purificar/clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:
El proceso de corte, autoligación y re-corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto en el que se produjo la ligación se puede ver identificando el sitio de corte de [enzima 1].
7. El gen se puede clonar para su posterior análisis.
Los genomas de otros organismos pueden analizarse de forma similar, aunque con diferentes elementos transponibles. El reciente descubrimiento del " transposón mariner " (a partir de la reconstrucción de la secuencia original a partir de muchas versiones "muertas" del genoma humano) ha permitido realizar muchos experimentos nuevos; el mariner tiene homólogos bien conservados en una amplia gama de especies y es una herramienta muy versátil.
Este artículo incorpora material del artículo de Citizendium "Los transposones como herramienta genética", que se encuentra bajo la licencia Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported pero no bajo la GFDL .