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haloetiqueta

La región codificante de la proteína HaloTag se puede insertar cerca del gen de interés. También se inserta un gen de resistencia a la ampicilina con fines de purificación.

HaloTag es una etiqueta proteica de autoetiquetado. Es una proteína de 297 residuos (33 kDa) derivada de una enzima bacteriana , diseñada para unirse covalentemente a un ligando sintético. La enzima bacteriana se puede fusionar con diversas proteínas de interés. [1] El ligando sintético se elige entre varios ligandos disponibles de acuerdo con el tipo de experimentos que se van a realizar. Esta enzima bacteriana es una haloalcano deshalogenasa , que actúa como una hidrolasa y está diseñada para facilitar la visualización de la localización subcelular de una proteína de interés, la inmovilización de una proteína de interés o la captura de los socios de unión de una proteína de interés dentro de su estructura bioquímica. ambiente. [2] El HaloTag está compuesto por dos segmentos unidos covalentemente que incluyen una haloalcano deshalogenasa y un ligando sintético de elección. Estos ligandos sintéticos consisten en un conector cloroalcano reactivo unido a un grupo funcional. [3] Los grupos funcionales pueden ser biotina (se puede usar como etiqueta de afinidad) o pueden elegirse entre cinco tintes fluorescentes disponibles, incluidos Coumarin, Oregon Green, Alexa Fluor 488, diAcFAM y TMR. Estos tintes fluorescentes se pueden utilizar en la visualización de células vivas o fijadas químicamente. [4]

Mecanismo

Cinco tintes fluorescentes disponibles que se pueden unir al conector reactivo. Además, se puede visualizar el cloro terminal del cloroalcano reactivo.

HaloTag es una hidrolasa, que tiene un sitio activo genéticamente modificado, que se une específicamente al conector cloroalcano reactivo y tiene una mayor tasa de unión al ligando. [5] La reacción que forma el enlace entre la etiqueta proteica y el conector cloroalcano es rápida y esencialmente irreversible en condiciones fisiológicas debido al cloro terminal de la porción del conector. [6] En la reacción antes mencionada, el ataque nucleofílico del conector reactivo cloroalcano provoca el desplazamiento del halógeno con un residuo de aminoácido, lo que da como resultado la formación de un intermediario alquil-enzima covalente. Este intermedio luego sería hidrolizado por un residuo de aminoácido dentro de la hidrolasa de tipo salvaje. [7] Esto conduciría a la regeneración de la enzima después de la reacción. Sin embargo, en la haloalcano deshalogenasa modificada (HaloTag), el intermedio de reacción no puede continuar a través de una reacción posterior porque no puede hidrolizarse debido a la mutación en la enzima. Esto hace que el intermedio persista como un aducto covalente estable con el que no existe una reacción inversa asociada. [8]

Usos

Diferentes partes de la proteína de fusión. Como se ilustra en la figura, la proteína HaloTag consta de un ligando sintético y un conector de cloroalcano reactivo. La proteína HaloTag está unida a la proteína de interés.

Las proteínas de fusión marcadas con Halo se pueden expresar utilizando técnicas de expresión de proteínas recombinantes estándar . [9] Además, hay varios vectores comerciales disponibles que solo requieren la inserción de un gen de interés. [10] Dado que las deshalogenasas bacterianas son relativamente pequeñas y las reacciones descritas anteriormente son extrañas a las células de los mamíferos, no hay interferencia por reacciones metabólicas endógenas de los mamíferos. [11] Una vez que se ha expresado la proteína de fusión, existe una amplia gama de áreas potenciales de experimentación que incluyen ensayos enzimáticos, imágenes celulares, matrices de proteínas, determinación de la localización subcelular y muchas posibilidades adicionales. [12]

Recientemente, HaloTag ha sido diseñado para crear biosensores híbridos de proteína + molécula pequeña de actividad neuronal. [13] Estos sensores experimentan un cambio conformacional en respuesta a picos de concentración de calcio durante la activación neuronal; este cambio conformacional modula la conformación de una molécula de tinte unida a HaloTag. [13]

Ver también

Referencias

  1. ^ Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C, et al. (junio de 2008). "HaloTag: una nueva tecnología de etiquetado de proteínas para imágenes celulares y análisis de proteínas". Biología Química ACS . 3 (6): 373–82. doi :10.1021/cb800025k. PMID  18533659.
  2. ^ Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY (abril de 2006). "La caja de herramientas fluorescente para evaluar la ubicación y función de las proteínas". Ciencia . 312 (5771): 217–24. Código Bib : 2006 Ciencia... 312.. 217G. doi : 10.1126/ciencia.1124618. PMID  16614209. S2CID  1288600.
  3. ^ Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A (mayo de 2006). "Una variante fluorescente de una proteína del coral pétreo Montipora facilita la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de un solo láser de doble color". Biotecnología de la Naturaleza . 24 (5): 577–81. doi :10.1038/nbt1207. PMID  16648840. S2CID  19616823.
  4. ^ Miller LW, Cornish VW (febrero de 2005). "Marcado químico selectivo de proteínas en células vivas". Opinión actual en biología química . 9 (1): 56–61. doi :10.1016/j.cbpa.2004.12.007. PMID  15701454.
  5. ^ Pries F, Kingma J, Krooshof GH, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Janssen DB (mayo de 1995). "La histidina 289 es esencial para la hidrólisis del intermedio alquil-enzima de la haloalcano deshalogenasa". La Revista de Química Biológica . 270 (18): 10405–11. doi : 10.1074/jbc.270.18.10405 . PMID  7737973.
  6. ^ Waugh DS (junio de 2005). "Aprovechar al máximo las etiquetas de afinidad". Tendencias en Biotecnología . 23 (6): 316–20. doi :10.1016/j.tibtech.2005.03.012. PMID  15922084.
  7. ^ Chen I, Ting AY (febrero de 2005). "Etiquetado de proteínas de sitio específico con moléculas pequeñas en células vivas". Opinión Actual en Biotecnología . 16 (1): 35–40. doi :10.1016/j.copbio.2004.12.003. PMID  15722013.
  8. ^ Marks KM, Nolan GP (agosto de 2006). "Estrategias de etiquetado químico para biología celular". Métodos de la naturaleza . 3 (8): 591–6. doi : 10.1038/nmeth906. PMID  16862131. S2CID  27848267.
  9. ^ Adams SR, Campbell RE, Gross LA, Martin BR, Walkup GK, Yao Y, et al. (mayo de 2002). "Nuevos ligandos biarsenicales y motivos de tetracisteína para el etiquetado de proteínas in vitro e in vivo: síntesis y aplicaciones biológicas". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 124 (21): 6063–76. doi :10.1021/ja017687n. PMID  12022841.
  10. ^ "Vectores HaloTag en Promega" . Consultado el 9 de febrero de 2017 .
  11. ^ Naested H, Fennema M, Hao L, Andersen M, Janssen DB, Mundy J (junio de 1999). "Un gen bacteriano de haloalcano deshalogenasa como marcador seleccionable negativo en Arabidopsis" (PDF) . El diario de las plantas . 18 (5): 571–6. doi :10.1046/j.1365-313x.1999.00477.x. hdl : 11370/3359ce65-5249-4057-bd7d-b22451ea5e85 . PMID  10417708.
  12. ^ Janssen DB (abril de 2004). "Evolución de haloalcano deshalogenasas". Opinión actual en biología química . 8 (2): 150–9. doi :10.1016/j.cbpa.2004.02.012. PMID  15062775.
  13. ^ ab Deo, Claire; Abdelfattah, Ahmed S.; Bhargava, Hersh K.; Berro, Adam J.; Falcó, Natalie; Farrants, Helen; Moeyaert, Benjamien; Chupanova, Mariam; Lavis, Lucas D.; Schreiter, Eric R. (junio de 2021). "El HaloTag como armazón general para indicadores quimiogenéticos sintonizables del rojo lejano". Biología Química de la Naturaleza . 17 (6): 718–723. doi :10.1038/s41589-021-00775-w. ISSN  1552-4469. PMID  33795886. S2CID  232763093.