La fragmentación del ADN es la separación o rotura de cadenas de ADN en pedazos. Puede ser realizado intencionalmente por personal de laboratorio o por células, o puede ocurrir de manera espontánea. La fragmentación espontánea o accidental del ADN es una fragmentación que se acumula gradualmente en una célula. Puede medirse, por ejemplo, mediante el ensayo Comet o mediante el ensayo TUNEL .
Su principal unidad de medida es el Índice de Fragmentación del ADN (DFI). [1] Una DFI del 20% o más reduce significativamente las tasas de éxito después de la ICSI. [1]
La fragmentación del ADN fue documentada por primera vez por Williamson en 1970 cuando observó fragmentos oligoméricos discretos que se producían durante la muerte celular en cultivos primarios de hígado neonatal. Describió el ADN citoplasmático aislado de células de hígado de ratón después del cultivo caracterizado por fragmentos de ADN con un peso molecular múltiplo de 135 kDa . Este hallazgo fue consistente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear. [2]
Intencional
La fragmentación del ADN suele ser necesaria antes de la construcción de la biblioteca o la subclonación de secuencias de ADN. Se han empleado una variedad de métodos que implican la rotura mecánica del ADN en los que el personal del laboratorio fragmenta el ADN. Dichos métodos incluyen sonicación, cizallamiento con aguja, nebulización, cizallamiento puntual y paso a través de una celda de presión. [3]
La digestión de restricción es la rotura intencional de cadenas de ADN en el laboratorio. Es un tratamiento basado en enzimas utilizado en biotecnología para cortar el ADN en hebras más pequeñas con el fin de estudiar las diferencias de longitud de los fragmentos entre individuos o para la clonación de genes. [4] Este método fragmenta el ADN mediante la escisión simultánea de ambas cadenas o mediante la generación de muescas en cada cadena de ADNbc para producir roturas de ADNbc. [5]
Cizallamiento acústico de la transmisión de ondas de energía acústica de alta frecuencia entregadas a una biblioteca de ADN. El transductor tiene forma de cuenco para que las ondas converjan en el objetivo de interés. [5]
La nebulización obliga al ADN a pasar a través de un pequeño orificio en una unidad nebulizadora , lo que da como resultado la formación de una fina niebla que se recoge. El tamaño del fragmento está determinado por la presión del gas utilizado para empujar el ADN a través del nebulizador, la velocidad a la que la solución de ADN pasa a través del orificio, la viscosidad de la solución y la temperatura. [5] [6]
La sonicación , un tipo de cizallamiento hidrodinámico, somete el ADN a cavitación acústica y cizallamiento hidrodinámico mediante la exposición a breves períodos de sonicación, lo que generalmente resulta en fragmentos de 700 pb. Para la fragmentación del ADN, la sonicación se aplica comúnmente en ciclos de ráfaga utilizando un sonicador de tipo sonda. [7]
El corte por hundimiento puntual, un tipo de corte hidrodinámico, utiliza una bomba de jeringa para crear fuerzas de corte hidrodinámicas empujando una biblioteca de ADN a través de una pequeña contracción abrupta. Alrededor del 90% de las longitudes de los fragmentos se encuentran dentro de un rango doble. [5]
El corte de la aguja crea fuerzas de corte al pasar bibliotecas de ADN a través de una aguja de pequeño calibre. [5] El ADN pasa a través de una aguja de calibre varias veces para romper físicamente el ADN en pedazos finos.
Las células de presión francesas hacen pasar el ADN a través de una válvula estrecha bajo alta presión para crear altas fuerzas de corte. [5] Con una prensa francesa, la fuerza de corte se puede modular cuidadosamente ajustando la presión del pistón. La prensa proporciona un solo paso a través del punto de máxima fuerza de corte, lo que limita el daño a estructuras biológicas delicadas debido al corte repetido, como ocurre en otros métodos de alteración.
En la fragmentación (tagmentación) mediada por transposomas, los transposomas se preparan con ADN que luego se corta para que los eventos de transposición den como resultado ADN fragmentado con adaptadores (en lugar de una inserción). La concentración relativa de transposomas y ADN debe ser apropiada.
Espontáneo
La fragmentación apoptótica del ADN es una fragmentación natural que realizan las células en la apoptosis (muerte celular programada). La fragmentación del ADN es una característica bioquímica de la apoptosis . En las células moribundas, el ADN es escindido por una endonucleasa que fragmenta la cromatina en unidades nucleosomales, que son múltiplos de oligómeros de aproximadamente 180 pb y aparecen como una escalera de ADN cuando se ejecutan en un gel de agarosa. [8] La enzima responsable de la fragmentación apoptótica del ADN es la ADNasa activada por caspasa . La CAD normalmente es inhibida por otra proteína, el inhibidor de la ADNasa activada por caspasa (ICAD) . Durante la apoptosis, la caspasa efectora apoptótica, caspasa 3, escinde ICAD y, por lo tanto, hace que CAD se active. [9]
Un nucleosoma , que consiste en ADN (gris) enrollado alrededor de un tetrámero de histona (coloreado). En la fragmentación apoptótica del ADN, el ADN se escinde en la región conectora internucleosomal , que es la parte del ADN que no envuelve las histonas.
CAD escinde el ADN en los sitios de enlace internucleosomal entre los nucleosomas, estructuras que contienen proteínas que se encuentran en la cromatina a intervalos de ~180 pb. Esto se debe a que el ADN normalmente está estrechamente envuelto alrededor de las histonas, las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios enlazadores son las únicas partes de la cadena de ADN que están expuestas y, por tanto, accesibles al CAD.
La fragmentación del ADN juega un papel importante en la ciencia forense, especialmente en la elaboración de perfiles de ADN .
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica para analizar las longitudes variables de fragmentos de ADN que resultan de la digestión de una muestra de ADN con una endonucleasa de restricción . La endonucleasa de restricción corta el ADN en un patrón de secuencia específico conocido como sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción. La presencia o ausencia de ciertos sitios de reconocimiento en una muestra de ADN genera longitudes variables de fragmentos de ADN, que se separan mediante electroforesis en gel . Luego se hibridan con sondas de ADN que se unen a una secuencia de ADN complementaria en la muestra. [14]
En el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se crean millones de copias exactas de ADN de una muestra biológica. Solía amplificar una región específica de una cadena de ADN (el objetivo del ADN). La mayoría de los métodos de PCR suelen amplificar fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kb), aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kb de tamaño. [14] La PCR también utiliza calor para separar las cadenas de ADN.
El ADN fragmentado durante la apoptosis, de un tamaño de 1 a 20 nucleosomas, puede aislarse selectivamente de las células fijadas en el fijador desnaturalizante etanol [15]
Referencias
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