Separación o rotura de cadenas de ADN en fragmentos
La fragmentación del ADN es la separación o rotura de las cadenas de ADN en pedazos. Puede ser realizada intencionalmente por personal de laboratorio o por células, o puede ocurrir espontáneamente. La fragmentación espontánea o accidental del ADN es la fragmentación que se acumula gradualmente en una célula. Puede medirse, por ejemplo, mediante el ensayo Comet o el ensayo TUNEL .
Su principal unidad de medida es el Índice de Fragmentación del ADN (DFI). [1] Un DFI del 20% o más reduce significativamente las tasas de éxito después de una ICSI. [1]
La fragmentación del ADN fue documentada por primera vez por Williamson en 1970, cuando observó fragmentos oligoméricos discretos que se producían durante la muerte celular en cultivos primarios de hígado neonatal. Describió el ADN citoplasmático aislado de células de hígado de ratón después del cultivo como caracterizado por fragmentos de ADN con un peso molecular que consistía en múltiplos de 135 kDa . Este hallazgo era coherente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear. [2]
Intencional
La fragmentación del ADN suele ser necesaria antes de la construcción de una biblioteca o la subclonación de secuencias de ADN. Se han empleado diversos métodos que implican la rotura mecánica del ADN cuando el personal de laboratorio fragmenta el ADN. Dichos métodos incluyen la sonicación, el corte con aguja, la nebulización, el corte por inmersión y el paso a través de una celda de presión. [3]
La digestión por restricción es la ruptura intencional en el laboratorio de cadenas de ADN. Es un tratamiento basado en enzimas que se utiliza en biotecnología para cortar el ADN en cadenas más pequeñas con el fin de estudiar las diferencias de longitud de los fragmentos entre individuos o para la clonación de genes. [4] Este método fragmenta el ADN ya sea por la escisión simultánea de ambas cadenas o por la generación de cortes en cada cadena de dsADN para producir roturas de dsADN. [5]
Corte acústico de la transmisión de ondas de energía acústica de alta frecuencia enviadas a una biblioteca de ADN. El transductor tiene forma de cuenco para que las ondas converjan en el objetivo de interés. [5]
La nebulización fuerza el ADN a pasar a través de un pequeño orificio en una unidad nebulizadora , lo que da como resultado la formación de una fina niebla que se recoge. El tamaño del fragmento está determinado por la presión del gas utilizado para empujar el ADN a través del nebulizador, la velocidad a la que la solución de ADN pasa a través del orificio, la viscosidad de la solución y la temperatura. [5] [6]
La sonicación , un tipo de cizallamiento hidrodinámico, somete al ADN a cavitación acústica y cizallamiento hidrodinámico mediante la exposición a breves períodos de sonicación, lo que generalmente da como resultado fragmentos de 700 pb. Para la fragmentación del ADN, la sonicación se aplica comúnmente en ciclos de ráfaga utilizando un sonicador de tipo sonda. [7]
El cizallamiento por puntos, un tipo de cizallamiento hidrodinámico, utiliza una bomba de jeringa para crear fuerzas de cizallamiento hidrodinámico al empujar una biblioteca de ADN a través de una pequeña contracción abrupta. Alrededor del 90 % de las longitudes de los fragmentos se encuentran dentro de un rango de dos veces. [5]
El corte con aguja crea fuerzas de corte al pasar bibliotecas de ADN a través de una aguja de calibre pequeño. [5] El ADN pasa a través de una aguja de calibre varias veces para desgarrar físicamente el ADN en pedazos finos.
Las celdas de presión francesa pasan el ADN a través de una válvula estrecha bajo alta presión para crear altas fuerzas de corte. [5] Con una prensa francesa, la fuerza de corte se puede modular cuidadosamente ajustando la presión del pistón. La prensa proporciona una sola pasada a través del punto de máxima fuerza de corte, lo que limita el daño a las delicadas estructuras biológicas debido al corte repetido, como ocurre en otros métodos de disrupción.
En la fragmentación mediada por transposomas (tagmentación), los transposomas se preparan con ADN que luego se corta de modo que los eventos de transposición resulten en ADN fragmentado con adaptadores (en lugar de una inserción). La concentración relativa de transposomas y ADN debe ser apropiada.
Espontáneo
La fragmentación del ADN apoptótica es una fragmentación natural que las células realizan en la apoptosis (muerte celular programada). La fragmentación del ADN es un sello bioquímico de la apoptosis . En las células moribundas, el ADN es escindido por una endonucleasa que fragmenta la cromatina en unidades nucleosomales, que son múltiplos de oligómeros de aproximadamente 180 pb y aparecen como una escalera de ADN cuando se ejecutan en un gel de agarosa. [8] La enzima responsable de la fragmentación del ADN apoptótica es la ADNasa activada por caspasa . La CAD normalmente es inhibida por otra proteína, el inhibidor de la ADNasa activada por caspasa (ICAD) . Durante la apoptosis, la caspasa efectora apoptótica, la caspasa 3, escinde la ICAD y, por lo tanto, hace que la CAD se active. [9]
Un nucleosoma , que consiste en ADN (gris) envuelto alrededor de un tetrámero de histonas (coloreado). En la fragmentación del ADN apoptótica, el ADN se escinde en la región de unión internucleosómica , que es la parte del ADN que no está envuelta alrededor de las histonas.
La CAD corta el ADN en los sitios de unión internucleosomales entre los nucleosomas, estructuras que contienen proteínas y que se encuentran en la cromatina a intervalos de ~180 pb. Esto se debe a que el ADN normalmente está firmemente envuelto alrededor de las histonas, las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios de unión son las únicas partes de la cadena de ADN que están expuestas y, por lo tanto, accesibles a la CAD.
La fragmentación del ADN juega un papel importante en la ciencia forense, especialmente en la elaboración de perfiles de ADN .
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica para analizar las longitudes variables de los fragmentos de ADN que resultan de la digestión de una muestra de ADN con una endonucleasa de restricción . La endonucleasa de restricción corta el ADN en un patrón de secuencia específico conocido como sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. La presencia o ausencia de ciertos sitios de reconocimiento en una muestra de ADN genera longitudes variables de fragmentos de ADN, que se separan mediante electroforesis en gel . Luego se hibridan con sondas de ADN que se unen a una secuencia de ADN complementaria en la muestra. [14]
En el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se crean millones de copias exactas de ADN a partir de una muestra biológica. Se utiliza para amplificar una región específica de una cadena de ADN (el ADN diana). La mayoría de los métodos de PCR suelen amplificar fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kb), aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kb de tamaño. [14] La PCR también utiliza calor para separar las cadenas de ADN.
El ADN fragmentado durante la apoptosis, de un tamaño de 1 a 20 nucleosomas, se puede aislar selectivamente de las células fijadas en el fijador desnaturalizante etanol [15].
Referencias
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