La fosforribosilglicinamida formiltransferasa ( EC 2.1.2.2), también conocida como glicinamida ribonucleótido transformilasa ( GAR Tfase ), [1] es una enzima con nombre sistemático 10-formiltetrahidrofolato: 5'-fosforribosilglicinamida N-formiltransferasa . [2] [3] [4] Esta enzima cataliza la siguiente reacción química
Esta enzima dependiente de tetrahidrofolato (THF) cataliza una sustitución acilo nucleófila del grupo formilo de 10-formiltetrahidrofolato (fTHF) a N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (GAR) para formar N 2 -formil-N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (fGAR) como se muestra arriba. [5] Esta reacción juega un papel importante en la formación de purina a través de la vía de biosíntesis de novo de purina . Esta vía crea monofosfato de inosina (IMP), un precursor del monofosfato de adenosina (AMP) y del monofosfato de guanosina (GMP). AMP es un bloque de construcción para importantes portadores de energía como ATP, NAD + y FAD , y moléculas de señalización como cAMP . El papel de GARTfase en la biosíntesis de novo de purinas lo convierte en un objetivo para los medicamentos contra el cáncer [6] y su sobreexpresión durante el desarrollo posnatal se ha relacionado con el síndrome de Down . [7] Hay dos tipos conocidos de genes que codifican la transformilasa GAR en Escherichia coli : purN y purT, mientras que en humanos sólo se encuentra purN. [8] Muchos residuos en el sitio activo se conservan en enzimas bacterianas, de levadura, aviares y humanas. [9]
En humanos, GARTfase es parte de una enzima trifuncional que también incluye la glicinamida ribonucleótido sintasa ( GARS ) y la aminoimidazol ribonucleótido sintetasa ( AIRS ). Esta proteína (110 kDa) cataliza los pasos 2, 3 y 5 de la biosíntesis de novo de purinas. La proximidad de estas unidades enzimáticas y la flexibilidad de la proteína sirven para aumentar el rendimiento de la vía. GARTfase se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína. [11]
La GARTfase humana ha sido cristalizada mediante el método de gota sentada por difusión de vapor y obtenidas imágenes en el Laboratorio de Radiación Sincrotrón de Stanford (SSRL) por al menos dos grupos. [ dieciséis]
La estructura se puede describir mediante dos subdominios que están conectados por una hoja beta de siete cadenas. El dominio N-terminal consta de un pliegue de mononucleótido tipo Rossman, con una parte de cuatro hebras de la lámina beta rodeada a cada lado por dos hélices alfa. La lámina beta continúa hacia el dominio C-terminal, donde por un lado está cubierta por una larga hélice alfa y por el otro está parcialmente expuesta al disolvente. Es la hendidura entre los dos subdominios donde se encuentra el sitio activo. [9]
La hendidura consta del sitio de unión de GAR y la bolsa de unión de folato. La bolsa de unión de folato está delimitada por la hendidura de unión de pteridina, la región de transferencia de formilo y la región de benzoilglutamato que unen la cabeza de pteridina y una cola de benzoilglutamato conectadas por un nitrógeno de fTHF unido a formilo. Esta región de unión al folato ha sido objeto de mucha investigación porque su inhibición por moléculas pequeñas ha llevado al descubrimiento de fármacos antineoplásicos. Se ha demostrado que el bucle de unión de folato cambia de conformación dependiendo del pH de la solución y, como tal, la transformilasa GAR humana muestra su mayor actividad alrededor de un pH de 7,5 a 8. Las condiciones de pH más bajo (~4,2) también cambian la conformación de los bucles de unión del sustrato (GAR). [1]
Klein et al. sugirió por primera vez un mecanismo asistido por moléculas de agua. Una sola molécula de agua posiblemente mantenida en su lugar mediante enlaces de hidrógeno con el grupo carboxilato del residuo persistente Asp144 transfiere protones del GAR-N al THF-N. El nitrógeno nucleofílico en el grupo amino terminal de GAR ataca el carbono carbonilo del grupo formilo en THF empujando carga negativa sobre el oxígeno. Klein sugiere que His108 estabiliza el estado de transición mediante enlaces de hidrógeno con el oxígeno cargado negativamente y que la reforma del doble enlace carbonilo da como resultado la ruptura del enlace THF-N-formilo. Los cálculos de Qiao et al. sugieren que la transferencia gradual de protones asistida por agua desde Gar-N a THF-N es 80-100 kj/mol más favorable que la transferencia concertada sugerida por Klein. El mecanismo mostrado es sugerido por Qiao et al., quienes ciertamente no consideraron los residuos circundantes en sus cálculos. [12] [13] Gran parte del mapeo temprano del sitio activo en GAR TFase se determinó con la enzima bacteriana debido a la cantidad disponible de su sobreexpresión en E. coli . [14] Usando un análogo de afinidad de dideazafolato de bromoacetilo, James Inglese y sus colegas identificaron por primera vez Asp144 como un residuo del sitio activo probablemente involucrado en el mecanismo de transferencia de formilo. [15]
Los estudios de la variante purT de la transformilasa GAR en E. coli encontraron que la reacción se produce a través de un intermediario de formil fosfato. Si bien la reacción in vitro puede realizarse sin THF, en general la reacción in vivo es la misma. [dieciséis]
GART cataliza el tercer paso en la biosíntesis de novo de purinas, la formación de N 2 -formil-N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (fGAR) mediante la adición de formilo a N 1 -(5-fosfo-D-ribosil )glicinamida (GAR). [4] En E. coli , la enzima purN es una proteína de 23 kDa [17] pero en humanos es parte de una proteína trifuncional de 110 kDa que incluye funcionalidades AIRS y GARS. [11] Esta proteína cataliza tres pasos diferentes de la vía de novo de las purinas.
Debido a su mayor tasa de crecimiento y requisitos metabólicos, las células cancerosas dependen de la biosíntesis de nucleótidos de novo para alcanzar los niveles de AMP y GMP necesarios. [18] Ser capaz de bloquear cualquiera de los pasos de la vía de novo de las purinas presentaría una reducción significativa en el crecimiento del tumor. Se han realizado estudios tanto sobre la unión del sustrato [19] como sobre el sitio de unión del folato [20] para encontrar inhibidores.
Se sospecha que GARTfase está relacionado con el síndrome de Down. El gen que codifica la proteína trifuncional humana GARS-AIRS-GART se encuentra en el cromosoma 21q22.1, en la región crítica del síndrome de Down. La proteína se sobreexpresa en el cerebelo durante el desarrollo posnatal de personas con síndrome de Down. Por lo general, esta proteína es indetectable en el cerebelo poco después del nacimiento, pero se encuentra en niveles elevados durante el desarrollo prenatal. [7] [21]
