Los ácidos grasos derivados de fosfolípidos ( PLFA ) se utilizan ampliamente en ecología microbiana como marcadores quimiotaxonómicos de bacterias y otros organismos. Los fosfolípidos son los lípidos primarios que componen las membranas celulares . Los fosfolípidos pueden saponificarse , lo que libera los ácidos grasos contenidos en su cola diglicérida . Una vez que se saponifican los fosfolípidos de una muestra desconocida, la composición del PLFA resultante se puede comparar con los PLFA de organismos conocidos para determinar la identidad del organismo de la muestra. El análisis de PLFA se puede combinar con otras técnicas, como el sondeo de isótopos estables para determinar qué microbios son metabólicamente activos en una muestra. El análisis PLFA fue iniciado por DC White en la Universidad de Tennessee, a principios y mediados de los años 1980. [1]
Los PLFA son un componente estructural esencial de todas las membranas celulares microbianas . El análisis PLFA es una técnica ampliamente utilizada para estimar la biomasa total y observar cambios amplios en la composición comunitaria de la microbiota viva del suelo y ambientes acuosos. Ha habido un gran interés en las PLFA en los últimos años, evidente por el gran aumento de referencias de revistas revisadas por pares sobre el tema. [2] Sin embargo, existe una creciente preocupación de que algunos investigadores estén asignando PLFA a clases microbianas específicas cuando en realidad esos PLFA están presentes en una amplia gama de formas de vida. [2] Los fosfolípidos pueden presentarse en muchas clases biológicas (como en raíces de plantas, hongos y bacterias del suelo), por lo que se debe tener cuidado al asignar excesivamente biomarcadores de PLFA a la clase incorrecta. Aunque los fosfolípidos se encuentran en muchas formas de vida diferentes, las cadenas laterales de ácidos grasos entre las diferentes formas de vida pueden ser bastante únicas. Los ácidos grasos poliinsaturados ( por ejemplo, 18:3 ω3c) se encuentran en plantas, algas y cianobacterias, pero a menudo no están presentes en las bacterias. Ácidos grasos monoinsaturados (particularmente en la posición omega-7), ácidos grasos saturados de cadena impar ( por ejemplo, 15:0), ácidos grasos de cadena ramificada (principalmente iso o anetiso y 10-metilo) y ácidos grasos de ciclopropano ( por ejemplo , 19:0) . ciclo ω7c) son sintetizados principalmente por bacterias. El ácido graso poliinsaturado, 18:2 ω6c ( ácido linoleico ), se encuentra en los hongos del suelo , mientras que el ácido graso monoinsaturado, 16:1 ω5c, predomina en los hongos micorrízicos arbusculares (HMA).
La premisa básica es que a medida que los organismos individuales (especialmente bacterias y hongos) mueren, los fosfolípidos se degradan rápidamente y se supone que el contenido restante de fosfolípidos de la muestra proviene de organismos vivos. Como los fosfolípidos de diferentes grupos de bacterias y hongos contienen una variedad de ácidos grasos algo inusuales , pueden servir como biomarcadores útiles para dichos grupos. Los perfiles y la composición de PLFA se pueden determinar purificando los fosfolípidos y luego escindiendo los ácidos grasos para su posterior análisis. El conocimiento de la composición y actividad metabólica de la microbiota en suelos, agua y materiales de desecho es útil para optimizar la producción de cultivos, en la biorremediación y en la comprensión de los ecosistemas microbianos . El análisis de la comunidad microbiana del suelo mediante PLFA ha sido una técnica ampliamente utilizada debido a la medición sensible y reproducible de las porciones dominantes de la microbiota del suelo y al hecho de que los PLFA no requieren el cultivo de los organismos. [3] Se ha demostrado que el muestreo de poblaciones de suelo mediante cultivo no es rentable y produce resultados sesgados debido a la diferente facilidad de cultivo de algunos organismos. El principal inconveniente del PLFA ha sido que el tiempo de extracción es muy largo y engorroso. Se ha desarrollado un nuevo procedimiento de extracción de PLFA en placa de 96 pocillos que representa un aumento de 4 a 5 veces en el rendimiento con respecto a los métodos tradicionales de extracción de PLFA. Este nuevo método, junto con nuevas herramientas de software para analizar los datos de PLFA, será útil para los laboratorios que realizan una gran cantidad de análisis de PLFA o para los laboratorios que desean comenzar la investigación de PLFA. [4]
Los primeros estudios de las comunidades microbianas vivas del suelo se basaron en gran medida en intentos de cultivar bacterias y hongos del suelo. Sin embargo, debido a la dificultad para cultivar muchos de los organismos, las diferentes tasas de crecimiento de los organismos y la mano de obra involucrada, esto resultó no ser satisfactorio. Un artículo de 1965 propuso utilizar moléculas producidas por los organismos como biomarcadores de las comunidades microbianas. [5] En las dos décadas siguientes, se lograron rápidos avances en el desarrollo de cromatógrafos de gases (GC) y de columnas capilares de sílice fundida para los instrumentos de GC, lo que permitió un mejor análisis de materiales biológicos , incluidos los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). El análisis de PLFA se puede utilizar para determinar la estructura y actividad de la comunidad microbiana mediante el uso de ácidos grasos "característicos". [6] El concepto básico es que el contenido de fosfolípidos representa organismos vivos, ya que estos compuestos se descomponen rápidamente en comunidades mixtas aeróbicas y que algunos de los componentes lipídicos neutros, como los lipopolisacáridos de las bacterias Gram negativas, no reflejan organismos vivos en el momento de muestreo.
Aunque el método de recolección de muestras es diferente para muestras de suelo, agua, etc., la extracción-derivatización es generalmente similar al siguiente protocolo de un artículo sobre comunidades microbianas del suelo. [7] Los lípidos se extrajeron de la muestra de suelo seca mediante el uso de una mezcla tampón de cloroformo-metanol-fosfato mediante una breve sonicación seguida de agitación durante 2 horas y centrifugación para sedimentar el material del suelo. Al líquido sobre el suelo se le añadió cloroformo y agua adicionales para provocar la separación del cloroformo que contiene lípidos de la fase tampón/metanol. Los lípidos se fraccionaron en una columna de extracción en fase sólida y los lípidos neutros, los ácidos grasos libres y otros materiales se descartaron y luego se secó la fase de fosfolípidos, antes de la esterificación para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) [7] para hacerlos adecuados para análisis.
El análisis por cromatografía de gases (GC) de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) es el método elegido para el análisis de PLFA del suelo. El GC está acoplado a un detector de espectrómetro de masas (MSD) o a un detector de ionización de llama (FID). El sistema GC-MS es más caro de adquirir y mantener, requiere una habilidad considerable para operarlo y normalmente se utiliza únicamente para análisis cualitativos. La identificación de ácidos grasos mediante el sistema GC-FID se utiliza normalmente para análisis cualitativos y cuantitativos de FAME, y normalmente depende de la comparación de los tiempos de retención de los compuestos de ácidos grasos desconocidos en comparación con los estándares FAME adquiridos. Para el análisis de PLFA se ha adoptado ampliamente un sistema de identificación microbiana basado en ácidos grasos disponible comercialmente (que utiliza GC-FID), que nombra y cuantifica de manera reproducible los FAME. [8]
Los actinomicetos son bacterias grampositivas que se encuentran entre las bacterias más comunes en el suelo, el agua dulce y el ambiente marino. Los actinomicetos participan activamente en la descomposición de la materia orgánica y dan lugar al rico olor "terroso" de los suelos recién labrados. Este grupo de bacterias produce ácidos grasos biomarcadores distintivos que tienen una rama metilo en el décimo carbono, como 10-metilo 16:0 y 10-metilo 18:0. [9] Algunas especies comunes de actinomicetos del suelo incluyen Rhodococcus , Nocardia , Corynebacterium y Streptomyces .
Las bacterias grampositivas incluyen especies aeróbicas de Bacillus, especialmente aquellas relacionadas con B. cereus y B. subtilis. Estas bacterias son comunes en el suelo a granel y aumentan en número en la rizosfera. Los perfiles de PLFA de estas especies Gram positivas tienen altos porcentajes de biomarcadores de ácidos grasos de cadena ramificada como 15:0 iso y 15:0 anteiso. Por tanto, la suma de los ácidos grasos iso y anteiso en un análisis de PLFA puede proporcionar una estimación de la abundancia de bacterias Gram positivas (distintas de los actinomicetos) en la muestra.
Las bacterias gramnegativas son un componente importante de la rizosfera de las plantas y mejoran el crecimiento de las plantas al aumentar la solubilidad del fosfato , produciendo compuestos ionóforos que aumentan la absorción de hierro u otros minerales y pueden producir compuestos antifúngicos . [10] Las bacterias gramnegativas producen altos niveles de ácidos grasos monoinsaturados ( p. ej. , 16:1 omega-7 y 18:1 omega-9) durante el metabolismo activo, pero convierten gran parte de la composición de ácidos grasos insaturados en ácidos grasos de ciclopropano ( p. ej. , 17: 0 ciclopropano y 19:0 ciclopropano) cuando el metabolismo y la división celular se ralentizan debido a la escasez de nutrición u otro tipo de estrés. Por tanto, en el análisis de PLFA, la suma de ácidos grasos monoinsaturados y ciclopropano puede proporcionar una estimación de la abundancia de bacterias Gram negativas. Una alta proporción de ciclopropano a ácido graso monoinsaturado indica condiciones de estrés. [3]
Las bacterias anaeróbicas en la agricultura son principalmente un factor en suelos con bajos niveles de oxígeno, como los que se encuentran a mayores profundidades, o en condiciones húmedas, como en los arrozales. Utilizando el análisis de PLFA en el muestreo inicial, los consorcios de bacterias y arqueas en el suelo de los arrozales eran aproximadamente 44% de bacterias aeróbicas, 32% de bacterias anaeróbicas facultativas y 24% de arqueas. En caso de inundaciones a más largo plazo, los niveles fueron del 27%, 36% y 37% respectivamente y la biomasa total fue significativamente menor. [11] Los dimetilacetales (DMA) formados durante la derivatización se consideran biomarcadores de bacterias anaeróbicas. [ cita necesaria ]
Las arqueas se distribuyen universalmente en los suelos y se ha demostrado que controlan la nitrificación en condiciones ácidas [12] y contribuyen a la oxidación del amoníaco en suelos agrícolas y forestales. [13] Sin embargo, como los fosfolípidos de las arqueas no están unidos por ésteres como en las bacterias, sino por éter, no están significativamente presentes en la preparación de muestras de PLFA de rutina, que está diseñada para escindir ácidos grasos unidos por ésteres.
Los hongos micorrizas arbusculares (HMA) penetran las paredes de las células corticales de aproximadamente el 80% de todas las familias de plantas vasculares, generando una relación simbiótica. Los hongos forman estructuras de membrana adyacentes a la membrana celular de la planta, lo que permite el intercambio de fósforo, compuestos de nitrógeno y minerales del hongo y la planta proporciona al hongo principalmente azúcares derivados de la fotosíntesis. Como los HMA son hongos simbióticos obligados, no viven libremente en el suelo. Las hifas de HMA en la raíz forman materiales lipídicos que luego se transportan a las hifas que se extienden hacia el suelo desde la raíz y, por lo tanto, pueden aparecer en una muestra de suelo. [14] Las vesículas son órganos de almacenamiento de lípidos de HMA y éstas y las hifas del suelo contienen ácidos grasos 18:2 w6c (a menudo utilizados como indicador del contenido de hongos en el análisis de PLFA), además de contener el ácido graso 16:1. w5c que ha sido recomendado como biomarcador de HMA (fracción PLFA:hifas de HMA y fracción NLFA:esporas de HMA). [15]
El muestreo de suelos agrícolas para el análisis de la composición química ( por ejemplo , pH, N, P, K, Ca, Mg, etc. ) se ha practicado durante mucho tiempo en la producción de cultivos y, si bien se ha reconocido la importancia de la microbiota del suelo, se necesitan herramientas para estudiar La microbiota se ha desarrollado relativamente recientemente.
Muchos cultivos de hortalizas de alto valor justifican fácilmente las pruebas del suelo tanto para determinar el contenido químico como la microbiota del suelo. [16] Los sistemas de agricultura convencionales, de bajos insumos y orgánicos mostraron una respuesta rápida de las comunidades microbianas del suelo a los ciclos húmedos/secos y que los aumentos en los ácidos grasos ciclopropílicos bacterianos fueron útiles para detectar períodos de estrés. [17] Se descubrió que las líneas de maíz transgénico que expresan endotoxinas de Bacillus thuringiensis tienen un efecto pequeño en las comunidades microbianas del suelo en comparación con el análisis de PLFA con sus isolíneas no transgénicas. [7] Las especies de plantas invasoras exóticas exitosas pueden tener efectos profundos en las comunidades microbianas del suelo [18] quizás mejorando así su competitividad. Las prácticas de restauración de pastizales de labranza , deshierbe y uso de herbicidas mostraron un impacto en las comunidades microbianas de la capa superior del suelo, pero cambios muy pequeños en la microbiota de las capas inferiores del suelo y que, después de 4 años de recuperación, las comunidades eran muy similares a las de las parcelas no tratadas. [19]
La biorremediación se ha estudiado mediante análisis PLFA de la microbiota del suelo de sitios contaminados por combustible diésel , [20] petróleo crudo, [21] explosivos, [22] residuos de almazara, [23] pentaclorofenol , [24] alquitrán de hulla [25] y PCB. . [26] Hay informes sobre los efectos sobre los PLFA de los metales pesados en los hongos arbusculares [27] y en las bacterias, [9] de los hidrocarburos aromáticos policíclicos en las bacterias del arrozal [28] y del cloruro de metileno en las bacterias. [29]
El fitoplancton ( algas eucariotas ) son plantas fotosintetizadoras microscópicas que habitan en las capas de océanos y cuerpos de agua dulce iluminadas por el sol. Como fuente principal de compuestos de carbono elaborados, son vitales para la red alimentaria acuática. El fitoplancton produce cantidades considerables de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), incluido el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 w3c), siendo las microalgas el origen de los ácidos grasos omega-3 en el aceite de pescado. [30] Los diversos grupos taxonómicos de las algas varían en abundancia dependiendo de las condiciones ambientales como la temperatura, la salinidad, la luz solar y la disponibilidad de nutrientes. Se descubrió que las composiciones de biomarcadores de PLFA permiten determinar la prevalencia de los grupos principales en varios entornos marinos. [31] En un estudio de depósitos sedimentarios de embalses, se asumió que el contenido de PUFA de la comunidad constituía ca. 50% del total de PLFA microeucariotas. [32] También se asumió que "La proporción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 describe la contribución relativa de los miembros fototróficos a los heterótrofos de la comunidad microeucariota..." [32]
En contraste con la considerable diversidad microbiana en los suelos, los microbios de vida libre distribuidos por las corrientes marinas y expuestos a exudados de algas exhiben distribuciones globales para unos pocos grupos microbianos dominantes de relativamente pocas especies. [33] Los sedimentos del lecho del arroyo mostraron una variación en la estructura de la comunidad microbiana (medida por PLFA) relacionada con el entorno forestal y la ubicación geográfica del arroyo, y gran parte de la variación se determinó mediante el uso del biomarcador de algas ácido graso 18:3 w3. [34] Mediante el análisis de PLFA, se determinaron variaciones espaciales y estacionales considerables en una comunidad microbiana sedimentaria de un depósito de agua dulce. [32]
Los bosques de coníferas dependen de los nutrientes disponibles en el suelo más que de los fertilizantes agrícolas y, por lo tanto, son colonizados habitualmente por hongos micorrízicos simbióticos. Las micorrizas pueden ser de tipo ectomicorrizas (EMF) y/o arbusculares (AMF) en el bosque. [35] La cantidad total de PLFA en el suelo proporciona una estimación del total de hongos del suelo (sin incluir los HMA). El HMA se puede estimar por la cantidad de ácido graso 16:1 w5c en el PLFA. [35] El estrés hídrico estuvo indicado por un aumento en [las proporciones de PLFA de saturado, monoinsaturado y (ciclo 17:0 + ciclo 19:0) / (16:1 w7c + 18:1 w7c)] en un bosque de abetos de Douglas. [36] Los bosques boreales con valores bajos de pH del suelo tenían PLFA EM elevados y el aumento del pH del suelo aumentó los PLFA bacterianos. [37] La introducción de fotosintatos a través de las raíces de los árboles es una fuente importante de carbono para la microbiota del suelo e influye en la composición de las comunidades de hongos y bacterias. [38] Las áreas forestales sin raíces de árboles tenían menos biomarcadores de hongos y más biomarcadores de actinobacterias que las áreas con raíces de árboles. [39] La adición de fertilizante nitrogenado a un bosque de robles redujo el contenido de hongos ectomicorrízicos de la microbiota del suelo. [40]
El compostaje de materiales orgánicos es la degradación microbiana de material orgánico heterogéneo en condiciones aeróbicas, húmedas y de autocalentamiento. Inicialmente, la actividad de los organismos mesófilos conduce a un rápido aumento de la temperatura, seguido de organismos termófilos que dominan el proceso de degradación y conducen a un período de enfriamiento en el que las bacterias mesófilas vuelven a dominar las poblaciones. Se comparó la efectividad de un protocolo de extracción comercial de FAME desarrollado para la identificación de bacterias, un protocolo de metanólisis alcalina suave y extracción/derivatización de PLFA. [41] El protocolo PLFA proporcionó la información más detallada sobre la sucesión de comunidades; sin embargo, los otros dos protocolos fueron mucho más simples y parecieron adecuados para el análisis de perfiles microbianos de FAME en compost. [41]
La tecnología de lodos activados es el método más utilizado para el tratamiento de aguas residuales. Se necesitan comunidades microbianas complejas en los procesos de lodos activados para lograr una eficiencia de eliminación estable de contaminantes orgánicos. El análisis de PLFA se puede utilizar para monitorear la composición de la comunidad microbiana de los reactores de lodos activados, qué grupos microbianos son predominantes y la eficiencia de dichos sistemas. [42] [43]
La composición de la comunidad microbiana del suelo en zonas de alta montaña es menos conocida en comparación con otras comunidades vegetales. La comunidad microbiana PLFA se puede caracterizar por su composición y su relación con la disponibilidad de N del suelo, la mineralización de N y el potencial de nitrificación. [44]