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Un fluorómetro , fluorímetro o fluorímetro es un dispositivo que se utiliza para medir parámetros de fluorescencia del espectro visible : su intensidad y distribución de longitudes de onda del espectro de emisión después de la excitación por un determinado espectro de luz. [1] Estos parámetros se utilizan para identificar la presencia y la cantidad de moléculas específicas en un medio. Los fluorómetros modernos son capaces de detectar concentraciones de moléculas fluorescentes tan bajas como 1 parte por billón.
El análisis de fluorescencia puede ser mucho más sensible que otras técnicas. Las aplicaciones incluyen química / bioquímica , medicina y monitoreo ambiental . Por ejemplo, se utilizan para medir la fluorescencia de la clorofila para investigar la fisiología de las plantas .
Normalmente los fluorómetros utilizan un haz doble. Estos dos haces funcionan en conjunto para disminuir el ruido creado por las fluctuaciones de energía radiante. El haz superior pasa a través de un filtro o monocromador y atraviesa la muestra. El haz inferior pasa a través de un atenuador y se ajusta para intentar igualar la potencia fluorescente emitida por la muestra. La luz de la fluorescencia de la muestra y el haz atenuado inferior se detectan mediante transductores separados y se convierten en una señal eléctrica que es interpretada por un sistema informático.
Dentro de la máquina, el transductor que detecta la fluorescencia creada a partir del haz superior está ubicado a una distancia de la muestra y en un ángulo de 90 grados desde el haz superior incidente. La máquina está construida de esta manera para disminuir la luz parásita del haz superior que puede incidir en el detector. El ángulo óptimo es de 90 grados. Existen dos enfoques diferentes para manejar la selección de la luz incidente, lo que da paso a diferentes tipos de fluorómetros. Si se utilizan filtros para seleccionar longitudes de onda de luz, la máquina se llama fluorómetro. Si bien un espectrofluorómetro normalmente usa dos monocromadores, algunos espectrofluorómetros pueden usar un filtro y un monocromador. Donde, en este caso, el filtro de banda ancha actúa para reducir la luz parásita, incluso procedente de órdenes de difracción no deseadas de la rejilla de difracción del monocromador.
Las fuentes de luz de los fluorómetros suelen depender del tipo de muestra que se analiza. Entre las fuentes de luz más comunes para los fluorómetros se encuentra la lámpara de mercurio de baja presión . Esto proporciona muchas longitudes de onda de excitación, lo que lo convierte en el más versátil. Sin embargo, esta lámpara no es una fuente continua de radiación. La lámpara de arco de xenón se utiliza cuando se necesita una fuente continua de radiación. Ambas fuentes proporcionan un espectro adecuado de luz ultravioleta que induce quimioluminiscencia . Éstas son sólo dos de las muchas fuentes de luz posibles. [ cita necesaria ]
Las cubetas de vidrio y sílice suelen ser los recipientes en los que se coloca la muestra. Se debe tener cuidado de no dejar huellas dactilares ni ningún otro tipo de marca en el exterior de la cubeta, ya que esto puede producir una fluorescencia no deseada. A veces se utilizan disolventes de "grado espectro", como el metanol, para limpiar las superficies del recipiente y minimizar estos problemas.
La fluorimetría es ampliamente utilizada por la industria láctea para verificar si la pasteurización ha sido exitosa. Esto se hace utilizando un reactivo que se hidroliza a un fluoróforo y ácido fosfórico mediante la fosfatasa alcalina de la leche. [2] Si la pasteurización ha tenido éxito, la fosfatasa alcalina se desnaturalizará por completo y la muestra no emitirá fluorescencia. Esto funciona porque los patógenos en la leche mueren mediante cualquier tratamiento térmico que desnaturalice la fosfatasa alcalina. [3] [4]
Los productores de leche del Reino Unido exigen ensayos de fluorescencia para demostrar que se ha producido una pasteurización exitosa, [5] por lo que todas las lecherías del Reino Unido contienen equipos de fluorimetría.
Las tioflavinas son colorantes utilizados para tinciones histológicas y estudios biofísicos de agregación de proteínas. [6] Por ejemplo, la tioflavina T se utiliza en la técnica RT-QuIC para detectar la encefalopatía espongiforme transmisible , que causa priones mal plegados .
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Los fluorómetros se utilizan ampliamente en oceanografía para medir las concentraciones de clorofila basándose en la fluorescencia de la clorofila por los pigmentos de las células del fitoplancton . La fluorescencia de la clorofila es un indicador ampliamente utilizado de la cantidad (biomasa) de algas microscópicas en el agua. En el laboratorio, después del muestreo de agua, los investigadores extraen los pigmentos de un filtro que tiene células de fitoplancton y luego miden la fluorescencia del extracto en un fluorómetro de mesa en una habitación oscura. [7] Para medir directamente la fluorescencia de la clorofila "in situ" (en el agua), los investigadores utilizan instrumentos diseñados para medir la fluorescencia ópticamente (por ejemplo, sondas con sensores ópticos electrónicos adicionales adjuntos). Los sensores ópticos emiten luz azul para excitar los pigmentos del fitoplancton y hacerlos fluorescentes o emitir luz roja. El sensor mide esta fluorescencia inducida midiendo la luz roja como voltaje y el instrumento la guarda en un archivo de datos. La señal de voltaje del sensor se convierte a una concentración con una curva de calibración en el laboratorio, utilizando tintes de color rojo como la rodamina , estándares como la fluoresceína o cultivos de fitoplancton vivos. [8]
La fluorescencia de la clorofila oceánica se mide en buques de investigación, pequeñas embarcaciones, boyas, muelles y embarcaderos de todo el mundo. Las mediciones de fluorometría se utilizan para mapear las concentraciones de clorofila en apoyo de la teledetección del color de los océanos . Los fluorómetros especiales para aguas oceánicas pueden medir propiedades más allá de la cantidad total de fluorescencia, como el rendimiento cuántico de la fotoquímica , el momento de la fluorescencia y la fluorescencia de las células cuando se las somete a cantidades crecientes de luz. [9] Las operaciones de acuicultura, como las piscifactorías, utilizan fluorómetros para medir la disponibilidad de alimentos para animales que se alimentan por filtración como los mejillones [10] y para detectar la aparición de floraciones de algas nocivas (FAN) y/o " mareas rojas " (no necesariamente lo mismo). . [11]
Se pueden utilizar fluorómetros para determinar la concentración de ácido nucleico en una muestra. [12]
Hay dos tipos básicos de fluorómetros: los fluorómetros de filtro y los espectrofluorómetros. La diferencia entre ellos es la forma en que seleccionan las longitudes de onda de la luz incidente; Los fluorómetros de filtro utilizan filtros, mientras que los espectrofluorómetros utilizan monocromadores de rejilla. Los fluorómetros con filtro a menudo se compran o construyen a un costo menor, pero son menos sensibles y tienen menos resolución que los espectrofluorómetros. Los fluorómetros de filtro también son capaces de funcionar sólo en las longitudes de onda de los filtros disponibles, mientras que los monocromadores generalmente se pueden sintonizar libremente en un rango relativamente amplio. La desventaja potencial de los monocromadores surge de esa misma propiedad, porque el monocromador es capaz de calibrarse o ajustarse incorrectamente, mientras que la longitud de onda de los filtros es fija cuando se fabrican.