Anisotropía de fluorescencia

La anisotropía de fluorescencia o polarización de fluorescencia es el fenómeno en el que la luz emitida por un fluoróforo tiene intensidades desiguales a lo largo de diferentes ejes de polarización . Entre los pioneros en este campo se encuentran Aleksander Jablonski , Gregorio Weber [ ^{1] y Andreas Albrecht [2]} . Los principios de la polarización de fluorescencia y algunas aplicaciones del método se presentan en el libro de Lakowicz ^[3] .

Definición de anisotropía de fluorescencia

La anisotropía (r) de una fuente de luz se define como la relación entre el componente polarizado y la intensidad total ( ): ^[3] ${\displaystyle I_{T}}$

${\displaystyle r={\frac {I_{z}-I_{y}}{I_{x}+I_{y}+I_{z}}}}$

Cuando la excitación está polarizada a lo largo del eje z, la emisión del fluoróforo es simétrica alrededor del eje z (Figura). Por lo tanto, estadísticamente tenemos . Como , y , tenemos ${\displaystyle I_{x}=I_{y}}$ ${\displaystyle I_{y}=I_{\perp }}$ ${\displaystyle I_{z}=I_{\parallel }}$

${\displaystyle r={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{\parallel }+2I_{\perp }}}={\frac {I_{\parallel }-I_{\perp }}{I_{T}}}}$.

Principio – Movimiento browniano y fotoselección

Movimiento browniano de una nanopartícula

En la fluorescencia , ^[4] una molécula absorbe un fotón y se excita a un estado de mayor energía. Después de un breve retraso (el promedio representado como el tiempo de vida de la fluorescencia ), desciende a un estado inferior perdiendo parte de la energía en forma de calor y emitiendo el resto de la energía en forma de otro fotón. La excitación y la desexcitación implican la redistribución de electrones alrededor de la molécula. Por lo tanto, la excitación por un fotón solo puede ocurrir si el campo eléctrico de la luz está orientado en un eje particular alrededor de la molécula. Además, el fotón emitido tendrá una polarización específica con respecto a la molécula. ${\displaystyle \tau }$

El primer concepto que hay que entender para las mediciones de anisotropía es el concepto de movimiento browniano . Aunque el agua a temperatura ambiente contenida en un vaso puede parecer muy quieta a simple vista, a nivel molecular cada molécula de agua tiene energía cinética y, por lo tanto, hay muchas colisiones entre moléculas de agua en cualquier cantidad de tiempo. Una nanopartícula (punto amarillo en la figura) suspendida en solución experimentará un recorrido aleatorio debido a la suma de estas colisiones subyacentes. El tiempo de correlación rotacional ( Φ _r ), el tiempo que tarda la molécula en rotar 1 radián, depende de la viscosidad ( η ), la temperatura (T), la constante de Boltzmann ( k _B ) y el volumen ( V ) de la nanopartícula: ^[5]

${\displaystyle \phi _{r}={{\eta V} \over {k{_{B}}T}}}$

El segundo concepto es la fotoselección mediante el uso de luz polarizada. Cuando se aplica luz polarizada a un grupo de fluoróforos orientados aleatoriamente, la mayoría de las moléculas excitadas serán aquellas orientadas dentro de un rango particular de ángulos con respecto a la polarización aplicada. Si no se mueven, la luz emitida también estará polarizada dentro de un rango particular de ángulos con respecto a la luz aplicada.

Para la excitación de un solo fotón, la anisotropía intrínseca r ₀ tiene un valor teórico máximo de 0,4 cuando los dipolos de excitación y emisión son paralelos y un valor mínimo de -0,2 cuando los dipolos de excitación y emisión son perpendiculares.

${\displaystyle {r_{0}}={2 \over 5}\left({{3{{\cos }^{2}}\beta -1} \over 2}\right)}$

donde β es el ángulo entre los dipolos de excitación y emisión. Para mediciones de fluorescencia en estado estacionario, generalmente se mide incorporando el fluoróforo en un poliol congelado .

Si tomamos el caso idealista más simple, un subconjunto de moléculas de colorante suspendidas en solución que tienen un tiempo de vida de fluorescencia monoexponencial y r0 ₌ 0,4 (6 g de rodamina en etilenglicol con una absorbancia de ~0,05 es una buena muestra de prueba), si la excitación no está polarizada, la emisión de fluorescencia medida también debería estar no polarizada. Sin embargo, si la fuente de excitación está polarizada verticalmente utilizando un polarizador de excitación, los efectos de polarización se detectarán en la fluorescencia medida. Estos artefactos de polarización se pueden combatir colocando un polarizador de emisión en el ángulo mágico de 54,7º. Si el polarizador de emisión está polarizado verticalmente, habrá una pérdida adicional de fluorescencia, ya que el movimiento browniano hace que las moléculas de colorante pasen de una configuración polarizada vertical inicial a una configuración no polarizada. Por otro lado, si el polarizador de emisión está polarizado horizontalmente, habrá una introducción adicional de moléculas excitadas que inicialmente estaban polarizadas verticalmente y se despolarizaron mediante el movimiento browniano. La suma y la diferencia de fluorescencia se pueden construir mediante la suma de las intensidades y la resta de las intensidades de fluorescencia respectivamente: ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle S={I_{VV}}+2G{I_{VH}}}$

${\displaystyle D={I_{VV}}-G{I_{VH}}}$

Dividiendo la diferencia por la suma se obtiene la desintegración de la anisotropía:

${\displaystyle r={D \over S}}$

El factor de rejilla G es una preferencia instrumental de la óptica de emisión de la orientación horizontal a la orientación vertical. Se puede medir moviendo el polarizador de excitación a la orientación horizontal y comparando las intensidades cuando el polarizador de emisión está polarizado vertical y horizontalmente respectivamente.

${\displaystyle G={{I_{HV}} \over {I_{HH}}}}$

G depende de la longitud de onda de emisión. Nota: G en la literatura se define como la inversa que se muestra.

El grado de decorrelación en la polarización de la luz incidente y emitida depende de la rapidez con la que se altera la orientación del fluoróforo (tiempo de vida rotacional ) en comparación con el tiempo de vida de la fluorescencia ( ). La alteración de las orientaciones puede ocurrir por el movimiento de toda la molécula o por la rotación de solo la parte fluorescente. La velocidad del movimiento está relacionada con la anisotropía medida por la ecuación de Perrin: ${\displaystyle \phi }$ ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle r(\tau )={\frac {r_{0}}{1+\tau /\tau _{c}}}}$

Donde r es la anisotropía observada, r ₀ es la anisotropía intrínseca de la molécula, es el tiempo de vida de la fluorescencia y es el tiempo de correlación rotacional. ^[6] ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau _{c}}$

Este análisis es válido únicamente si los fluoróforos están relativamente alejados entre sí. Si están muy cerca uno del otro, pueden intercambiar energía mediante FRET y, dado que la emisión puede producirse a partir de una de muchas moléculas que se mueven (u orientan) de forma independiente, esto da como resultado una anisotropía menor de la esperada o una decorrelación mayor. Este tipo de transferencia de energía por resonancia de Förster de homotransferencia se denomina FRET de migración de energía o emFRET .

La anisotropía de fluorescencia en estado estacionario solo proporciona una anisotropía "promedio". Se puede obtener mucha más información con la anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo ^[7], donde el tiempo de decaimiento, la anisotropía residual y el tiempo de correlación rotacional se pueden determinar a partir del ajuste del decaimiento de la anisotropía. Normalmente se utiliza una fuente láser pulsada verticalmente para la excitación y se añaden componentes electrónicos de sincronización entre los pulsos de inicio del láser (inicio) y la medición de los fotones de fluorescencia (fin). Normalmente se emplea la técnica de conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC).

Nuevamente, utilizando el caso idealista más simple, un subconjunto de moléculas de tinte suspendidas en solución que tienen un tiempo de vida de fluorescencia monoexponencial y una anisotropía inicial r ₀ = 0,4. Si la muestra se excita con una fuente de excitación pulsada orientada verticalmente, se debe medir un solo tiempo de decaimiento cuando el polarizador de emisión está en el ángulo mágico. Si el polarizador de emisión está polarizado verticalmente, en cambio, se medirán dos tiempos de decaimiento, ambos con factores preexponenciales positivos; el primer tiempo de decaimiento debe ser equivalente al medido con la configuración de emisión no polarizada y el segundo tiempo de decaimiento se deberá a la pérdida de fluorescencia, ya que el movimiento browniano hace que las moléculas de tinte se muevan de una configuración polarizada vertical inicial a una configuración no polarizada. Por otro lado, si el polarizador de emisión está polarizado horizontalmente, se recuperarán nuevamente dos tiempos de decaimiento, el primero con un factor preexponencial positivo y será equivalente a pero el segundo tendrá un factor preexponencial negativo resultante de la introducción de moléculas excitadas que inicialmente estaban polarizadas verticalmente y se despolarizaron mediante el movimiento browniano. La suma y la diferencia de fluorescencia se pueden construir mediante la adición y la resta de los decaimientos de fluorescencia respectivamente: ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle S(t)=G{I_{VV}}(t)+2{I_{VH}}(t)}$

${\displaystyle D(t)=G{I_{VV}}(t)-{I_{VH}}(t)}$

Dividiendo la diferencia por la suma se obtiene la desintegración de la anisotropía:

${\displaystyle r(t)={D(t) \over S(t)}}$

En el caso más simple para una sola especie de tinte esférico:

${\displaystyle r(t)={r_{0}}\exp \left({-{t \over {\phi _{r}}}}\right)}$

Aplicaciones

La anisotropía de fluorescencia se puede utilizar para medir las constantes de unión y la cinética de las reacciones que provocan un cambio en el tiempo de rotación de las moléculas. Si el fluoróforo es una molécula pequeña, la velocidad a la que gira puede disminuir significativamente cuando está unido a una proteína grande. Si el fluoróforo está unido a la proteína más grande en un par de unión, la diferencia en la polarización entre los estados unido y no unido será menor (porque la proteína no unida ya será bastante estable y girará lentamente para empezar) y la medición será menos precisa. El grado de unión se calcula utilizando la diferencia en la anisotropía de los estados parcialmente unido, libre y completamente unido (gran exceso de proteína) medidos titulando los dos socios de unión.

Si el fluoróforo está unido a una molécula relativamente grande, como una proteína o un ARN, el cambio en la movilidad que acompaña al plegamiento se puede utilizar para estudiar la dinámica del plegamiento. Esto proporciona una medida de la dinámica de cómo la proteína logra su forma 3D final y estable. En combinación con fluoróforos que interactúan mediante transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), la anisotropía de fluorescencia se puede utilizar para detectar el estado oligomérico de las moléculas que forman complejos ( "¿Cuántas de las moléculas están interactuando?" ). ^[8]

La anisotropía de fluorescencia también se aplica a la microscopía, con el uso de polarizadores en el camino de la luz de iluminación y también delante de la cámara. Esto se puede utilizar para estudiar la viscosidad local del citosol o las membranas, y estas últimas proporcionan información sobre la microestructura de la membrana y las concentraciones relativas de varios lípidos. Esta técnica también se ha utilizado para detectar la unión de moléculas a sus parejas en cascadas de señalización en respuesta a ciertas señales.

El fenómeno de emFRET y la disminución asociada de la anisotropía cuando ocurren interacciones cercanas entre fluoróforos se ha utilizado para estudiar la agregación de proteínas en respuesta a la señalización.

Véase también

• Transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET)
  • Transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET)
• Anisotropía magnética
• Factores de fricción de Perrin

Referencias

1. Weber, G., 1953. Movimiento browniano rotacional y polarización de la fluorescencia de soluciones. Adv. Protein Chem. 8:415-459
2. Albrecht, A., 1961. Polarizaciones y asignaciones de transiciones: el método de fotoselección. J. Mol. Spectrosc. 6:84-108.
3. Lakowicz, JR, 2006. Principios de espectroscopia de fluorescencia (3.ª ed., Springer. Los capítulos 10-12 tratan sobre la espectroscopia de polarización de fluorescencia).
4. Miller, JN, ed. (1981). Estándares en espectrometría de fluorescencia - Espectrometría ultravioleta | J. Miller | Springer. Técnicas en espectrometría visible y ultravioleta. Springer. doi :10.1007/978-94-009-5902-6. ISBN 9789400959040. Recuperado el 16 de enero de 2016 .
5. Birch, David JS; Yip, Philip (1 de enero de 2014). "Nanometrology" (PDF) . En Engelborghs, Yves; Visser, Antonie JWG (eds.). Espectroscopia y microscopía de fluorescencia . Métodos en biología molecular. Vol. 1076. Humana Press . págs. 279–302. doi :10.1007/978-1-62703-649-8_11. ISBN . 978-1-62703-648-1. Número de identificación personal  24108630.
6. Valeur, Bernard. 2001. Fluorescencia molecular: principios y aplicaciones Wiley-VCH, p.29
7. Birch, David JS; Imhof, Robert E. (1 de enero de 2002). "Espectroscopia de fluorescencia en el dominio del tiempo mediante conteo de fotones individuales correlacionados con el tiempo". En Lakowicz, Joseph R. (ed.). Temas de espectroscopia de fluorescencia . Vol. 1. Springer US . págs. 1–95. doi :10.1007/0-306-47057-8_1. ISBN. 978-0-306-43874-5.
8. Heckmeier, Philipp J.; Agam, Ganesh; Teese, Mark G.; Hoyer, Maria; Stehle, Ralf; Lamb, Don C.; Langosch, Dieter (julio de 2020). "Determinación de la estequiometría de oligómeros de proteínas pequeñas mediante anisotropía de fluorescencia en estado estacionario". Revista biofísica . 119 (1): 99–114. Bibcode :2020BpJ...119...99H. doi : 10.1016/j.bpj.2020.05.025 . PMC 7335908 . PMID  32553128.