Fluorescencia de la clorofila

Luz reemitida por las moléculas de clorofila durante el retorno de estados excitados a no excitados

Un extracto de clorofila en alcohol mostrado bajo luz blanca (arriba) y luz ultravioleta que induce fluorescencia (abajo).

Imágenes de microscopio confocal de una hoja de tomate de Solanum lycopersicum . Imagen DIC de campo claro que muestra células oclusivas y células del pavimento (arriba). La misma región muestra autofluorescencia de clorofila A con excitación láser de 440 nm y emisión en rojo lejano (abajo).

Imágenes microscópicas de una hoja de musgo de Plagiomnium undulatum . Microscopía de campo claro en la parte superior y microscopía de fluorescencia en la parte inferior. La fluorescencia roja proviene de la clorofila de los cloroplastos.

La fluorescencia de la clorofila es la luz reemitida por las moléculas de clorofila durante el retorno de estados excitados a no excitados . Se utiliza como un indicador de la conversión de energía fotosintética en plantas , algas y bacterias . La clorofila excitada disipa la energía de la luz absorbida impulsando la fotosíntesis (conversión de energía fotoquímica), como calor en la extinción no fotoquímica o por emisión como radiación de fluorescencia. Como estos procesos son procesos complementarios, el análisis de la fluorescencia de la clorofila es una herramienta importante en la investigación de plantas con un amplio espectro de aplicaciones. ^{[1] [2]}

El efecto Kautsky

Al iluminar una hoja adaptada a la oscuridad, se produce un rápido aumento de la fluorescencia del fotosistema II (PSII), seguido de una disminución lenta. Esto fue observado por primera vez por Kautsky et al. en 1932 y se denomina efecto Kautsky. Este aumento variable de la fluorescencia de la clorofila se debe al fotosistema II. ^[3] La fluorescencia del fotosistema I no es variable, sino constante. ^[3]

El aumento de la fluorescencia se debe a que los centros de reacción del PSII se encuentran en un estado "cerrado" o químicamente reducido. ^[4] Los centros de reacción están "cerrados" cuando no pueden aceptar más electrones. Esto ocurre cuando los aceptores de electrones aguas abajo del PSII aún no han pasado sus electrones a un portador de electrones posterior, por lo que no pueden aceptar otro electrón. Los centros de reacción cerrados reducen la eficiencia fotoquímica general y, por lo tanto, aumentan el nivel de fluorescencia. Transferir una hoja de la oscuridad a la luz aumenta la proporción de centros de reacción del PSII cerrados, por lo que los niveles de fluorescencia aumentan durante 1-2 segundos. Posteriormente, la fluorescencia disminuye en unos pocos minutos. Esto se debe a; 1. más "apagado fotoquímico" en el que los electrones son transportados fuera del PSII debido a las enzimas involucradas en la fijación de carbono; y 2. más "apagado no fotoquímico" en el que más energía se convierte en calor.

Medición de fluorescencia

Generalmente, la medición inicial es el nivel mínimo de fluorescencia, que es la fluorescencia en ausencia de luz fotosintética. ^[5] ${\displaystyle \,F_{0}}$

Para utilizar las mediciones de fluorescencia de la clorofila para analizar la fotosíntesis, los investigadores deben distinguir entre extinción fotoquímica y extinción no fotoquímica (disipación de calor). Esto se logra deteniendo la fotoquímica, lo que permite a los investigadores medir la fluorescencia en presencia de extinción no fotoquímica únicamente. Para reducir la extinción fotoquímica a niveles insignificantes, se aplica un destello de luz corto y de alta intensidad a la hoja. Esto cierra transitoriamente todos los centros de reacción del PSII, lo que evita que la energía del PSII pase a los portadores de electrones aguas abajo. La extinción no fotoquímica no se verá afectada si el destello es corto. Durante el destello, la fluorescencia alcanza el nivel alcanzado en ausencia de cualquier extinción fotoquímica, conocido como fluorescencia máxima . ^[5] ${\displaystyle \,F_{m}}$

La eficiencia del apagado fotoquímico (que es un indicador de la eficiencia del PSII) se puede estimar comparándola con el rendimiento constante de fluorescencia en la luz y el rendimiento de fluorescencia en ausencia de luz fotosintética . La eficiencia del apagado no fotoquímico se altera por varios factores internos y externos. Las alteraciones en la disipación de calor significan cambios en . La disipación de calor no se puede detener por completo, por lo que no se puede medir el rendimiento de la fluorescencia de la clorofila en ausencia de apagado no fotoquímico. Por lo tanto, los investigadores utilizan un punto adaptado a la oscuridad ( ) con el que comparar las estimaciones del apagado no fotoquímico. ^[5] ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{t}}$ ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle F_{m}^{0}}$

Parámetros de fluorescencia habituales

${\displaystyle \,F_{0}}$: Fluorescencia mínima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la oscuridad cuando todos los centros de reacción del fotosistema II están abiertos.

${\displaystyle \,F_{m}}$: Fluorescencia máxima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la oscuridad cuando se ha aplicado un pulso de alta intensidad. Todos los centros de reacción del fotosistema II están cerrados.

${\displaystyle \,{F_{0}}'}$: Fluorescencia mínima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la luz cuando todos los centros de reacción del fotosistema II están abiertos; se reduce con respecto a mediante extinción no fotoquímica. ${\displaystyle \,F_{0}}$

${\displaystyle \,{F_{m}}'}$: Fluorescencia máxima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la luz cuando se ha aplicado un pulso de alta intensidad. Todos los centros de reacción del fotosistema II están cerrados.

${\displaystyle \,F_{t}}$: Fluorescencia terminal en estado estacionario (unidades arbitrarias). Un nivel de fluorescencia en estado estacionario disminuido (= extinguido) por procesos fotoquímicos y no fotoquímicos.

${\displaystyle \,T_{1/2}}$:Tiempo de subida medio de a . ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$

Parámetros calculados

${\displaystyle \,F_{v}}$es fluorescencia variable. Calculada como = - . ^[6] ${\displaystyle \,F_{v}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{0}}$

${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$es la relación entre la fluorescencia variable y la fluorescencia máxima. Calculada como . ^[7] Esta es una medida de la eficiencia máxima de PSII (la eficiencia si todos los centros de PSII estuvieran abiertos). se puede utilizar para estimar la eficiencia potencial de PSII tomando mediciones adaptadas a la oscuridad. ${\displaystyle {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m}}}}$ ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

${\displaystyle \,\Phi _{PSII}}$mide la eficiencia del fotosistema II. Calculado como = . ^[8] Este parámetro mide la proporción de luz absorbida por el PSII que se utiliza en fotoquímica. Como tal, puede dar una medida de la tasa de transporte lineal de electrones y, por lo tanto, indica la fotosíntesis general. ${\displaystyle \,Y_{(II)}}$ ${\displaystyle {\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'}}}$

${\displaystyle \,qP}$(apagado fotoquímico). Calculado como . ^[9] Este parámetro aproxima la proporción de centros de reacción de PSII que están abiertos. ${\displaystyle \,{\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}}$

Mientras que da una estimación de la eficiencia y nos dice qué procesos han alterado la eficiencia. El cierre de los centros de reacción como resultado de una luz de alta intensidad alterará el valor de . Los cambios en la eficiencia del apagado no fotoquímico alterarán la relación . ${\displaystyle \,\Phi _{PSII}}$ ${\displaystyle \,qP}$ ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$ ${\displaystyle \,qP}$ ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

Aplicaciones de la teoría

Rendimiento del PSII como medida de la fotosíntesis

La fluorescencia de la clorofila parece ser una medida de la fotosíntesis, pero esto es una simplificación excesiva. La fluorescencia puede medir la eficiencia de la fotoquímica del PSII, que se puede utilizar para estimar la tasa de transporte lineal de electrones al multiplicarla por la intensidad de la luz. Sin embargo, los investigadores generalmente se refieren a la fijación de carbono cuando se refieren a la fotosíntesis. El transporte de electrones y la fijación de CO ₂ pueden correlacionarse bien, pero es posible que no lo hagan en el campo debido a procesos como la fotorrespiración, el metabolismo del nitrógeno y la reacción de Mehler .

Relación del transporte de electrones con la fijación del carbono

Una técnica de investigación poderosa es medir simultáneamente la fluorescencia de la clorofila y el intercambio de gases para obtener una imagen completa de la respuesta de las plantas a su entorno. Una técnica es medir simultáneamente la fijación de CO2 _y la fotoquímica del PSII a diferentes intensidades de luz, en condiciones no fotorrespiratorias. Un gráfico de la fijación de CO2 _y la fotoquímica del PSII indica el requerimiento de electrones por molécula de CO2 _fijada . A partir de esta estimación, se puede estimar el grado de fotorrespiración . Esto se ha utilizado para explorar la importancia de la fotorrespiración como mecanismo fotoprotector durante la sequía.

El análisis de fluorescencia también se puede aplicar para comprender los efectos de las temperaturas altas y bajas.

• Sobrado (2008) ^[10] investigó el intercambio de gases y las respuestas de fluorescencia de clorofila a la luz de alta intensidad, de especies pioneras y especies forestales. El intercambio de gases de las hojas al mediodía se midió utilizando un sistema de fotosíntesis , que midió la tasa fotosintética neta, gs, y la concentración intercelular de CO ₂ ( ). En las mismas hojas utilizadas para las mediciones de intercambio de gases, se midieron los parámetros de fluorescencia de clorofila a (inicial, ; máximo, ; y variable, ) utilizando un fluorómetro. Los resultados mostraron que a pesar de que las especies pioneras y las especies forestales ocupan diferentes hábitats, ambas mostraron una vulnerabilidad similar a la fotoinhibición del mediodía en hojas expuestas al sol. ${\displaystyle C_{i}}$ ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{v}}$

Medición del estrés y la tolerancia al estrés

La fluorescencia de la clorofila puede medir la mayoría de los tipos de estrés de las plantas . La fluorescencia de la clorofila se puede utilizar como indicador del estrés de las plantas porque el estrés ambiental, por ejemplo, las temperaturas extremas, la luz y la disponibilidad de agua, pueden reducir la capacidad de una planta para metabolizar normalmente. Esto puede significar un desequilibrio entre la absorción de energía luminosa por la clorofila y el uso de energía en la fotosíntesis. ^[11]

• Favaretto et al. (2010) ^[12] investigaron la adaptación a un ambiente de luz intensa en especies pioneras y de sucesión tardía, cultivadas bajo 100% y 10% de luz. Se midieron numerosos parámetros, incluida la fluorescencia de la clorofila a . Se observó una mayor disminución de la luz solar total en las especies de sucesión tardía que en las especies pioneras. En general, sus resultados muestran que las especies pioneras se desempeñan mejor bajo luz solar intensa que las especies de sucesión tardía, lo que sugiere que las plantas pioneras tienen una mayor tolerancia potencial al daño fotooxidativo. ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

• Neocleous y Vasilakakis (2009) ^[6] investigaron la respuesta de la frambuesa al estrés por boro y sal . Se utilizó un fluorómetro de clorofila para medir , y . La fluorescencia de la clorofila de la hoja no se vio afectada significativamente por la concentración de NaCl cuando la concentración de B era baja. Cuando se aumentó B, la fluorescencia de la clorofila de la hoja se redujo en condiciones salinas. Se podría concluir que el efecto combinado de B y NaCl en las frambuesas induce un efecto tóxico en los parámetros fotoquímicos. ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{v}}$
• Lu y Zhang (1999) estudiaron el estrés térmico en plantas de trigo y descubrieron que la estabilidad de la temperatura en el fotosistema II de las hojas estresadas por el agua se correlaciona positivamente con la resistencia en el metabolismo durante la fotosíntesis. ^[13]

Índice de balance de nitrógeno

Ejemplo de un fluorómetro multiparamétrico portátil que utiliza la relación entre clorofila y flavonoles para detectar la deficiencia de nitrógeno de las plantas

Debido al vínculo entre el contenido de clorofila y el contenido de nitrógeno en las hojas, los fluorómetros de clorofila se pueden utilizar para detectar la deficiencia de nitrógeno en las plantas, mediante varios métodos .

Según varios años de investigación y experimentación, los polifenoles pueden ser indicadores del estado de nitrógeno de una planta. Por ejemplo, cuando una planta se encuentra en condiciones óptimas, favorece su metabolismo primario y sintetiza proteínas (moléculas de nitrógeno) que contienen clorofila y algunos flavonoles (compuestos secundarios basados ​​en carbono). Por otro lado, en caso de falta de nitrógeno, observaremos un aumento de la producción de flavonoles por parte de la planta. ^[14]

El NBI (Índice de Balance de Nitrógeno) de Force-A, permite evaluar las condiciones de nitrógeno de un cultivo calculando la relación entre Clorofila y Flavonoles (relacionado con la asignación Nitrógeno/Carbono).

Medir el contenido de clorofila

Gitelson (1999) afirma: "Se encontró que la relación entre la fluorescencia de clorofila a 735 nm y el rango de longitud de onda de 700 nm a 710 nm, F735/F700, era linealmente proporcional al contenido de clorofila (con un coeficiente de determinación, r2, mayor que 0,95) y, por lo tanto, esta relación se puede utilizar como un indicador preciso del contenido de clorofila en las hojas de las plantas". ^[15]

Fluorómetros de clorofila

Imagen de fluorescencia (valor Ft) de la superficie adaxial de la hoja

El desarrollo de los fluorómetros permitió que el análisis de la fluorescencia de la clorofila se convirtiera en un método común en la investigación de plantas. El análisis de la fluorescencia de la clorofila se ha visto revolucionado por la invención de la técnica de modulación de amplitud de pulso (PAM) ^{[16] [17]} y la disponibilidad del primer fluorómetro de clorofila modulado comercial PAM-101 (Walz, Alemania). Mediante la modulación del haz de luz de medición (pulsos de rango de microsegundos) y la detección paralela de la fluorescencia excitada, se puede determinar el rendimiento de fluorescencia relativa (Ft) en presencia de luz ambiental. Fundamentalmente, esto significa que la fluorescencia de la clorofila se puede medir en el campo incluso a plena luz del sol. ^[5]

En la actualidad, los fluorómetros de clorofila están diseñados para medir muchos mecanismos diferentes de las plantas. Los protocolos de medición: F _V /F _M y OJIP miden la eficiencia de las muestras del fotosistema II en un estado común y conocido adaptado a la oscuridad. Estos protocolos son útiles para medir muchos tipos de estrés de las plantas. ^[18] El protocolo de medición adaptado a la luz de Bernard Genty ΔF/F _M ', o Y(II), es una forma eficaz y sensible de medir muestras de plantas en condiciones de iluminación ambiental o artificial. ^[19] Sin embargo, dado que los valores de Y(II) también cambian con la intensidad de la luz, se deben comparar muestras a la misma intensidad de luz a menos que el estrés lumínico sea el foco de la medición. Y(II) puede ser más sensible a algunos tipos de estrés de las plantas que F _V /F _M , como el estrés térmico. ^[20]

También se han desarrollado otros protocolos de medición de los mecanismos de las plantas. Cuando un cloroplasto absorbe luz, parte de la energía luminosa se destina a la fotoquímica, parte a la disipación de calor regulada y parte a la disipación de calor no regulada. ^[21] Existen varios parámetros de medición de la fluorescencia de la clorofila para medir todos estos eventos. En el modelo del lago, q _L mide la extinción fotoquímica, Y(NYO) mide la disipación de calor regulada de la planta y Y(NO) mide la disipación de calor no regulada. ^[21] Un protocolo de extinción más antiguo, llamado modelo de charco, utiliza q _P para la extinción fotoquímica, q _N para la extinción no fotoquímica de la disipación de calor regulada y no regulada y NPQ para una estimación de la extinción no fotoquímica. ^[22] NPQ también se ha resucitado matemáticamente en el modelo del lago. ^[23]

Además, se han desarrollado los parámetros q _{E y pNPQ para medir el ciclo fotoprotector de las xantofilas.} ^{[24] [25]} q _T es una medida de las transiciones de estado. ^[26] q _M es una medida de la migración de cloroplastos, ^[27] y q _I es una medida de la fotoinhibición de la planta. ^[28]

A niveles de luz actínica más bajos NPQ = qE+qT+qI ^[24]

A altos niveles de luz actínica NPQ = qE+qM=qI ^[27]

Algunos fluorómetros están diseñados para ser portátiles y operarse con una sola mano.

El desarrollo continuo de los fluorómetros de imágenes facilita la visualización de heterogeneidades espaciales en la actividad fotosintética de las muestras. Estas heterogeneidades ocurren naturalmente en las hojas de las plantas, por ejemplo, durante el crecimiento, diversos tipos de estrés ambiental o infecciones por patógenos. Por lo tanto, el conocimiento sobre las heterogeneidades de las muestras es importante para la correcta interpretación del rendimiento fotosintético de la muestra de la planta. Los sistemas de fluorómetros de imágenes de alto rendimiento brindan opciones para analizar células individuales o cloroplastos individuales, así como áreas de muestra que cubren hojas o plantas enteras.

Enfoques alternativos

Sensores LIF

Las técnicas basadas en el efecto Kautsky no agotan la variedad de métodos de detección y evaluación basados ​​en la fluorescencia de la clorofila. En particular, los recientes avances en el área de la fluorescencia inducida por láser (LIF) también brindan la oportunidad de desarrollar sensores suficientemente compactos y eficientes para el estado fotofisiológico y las evaluaciones de biomasa. En lugar de medir la evolución del flujo de fluorescencia total, estos sensores registran la densidad espectral de este flujo excitado por fuertes pulsos de luz láser monocromática de duración de nanosegundos. Al no requerir un período de adaptación a la oscuridad de 15 a 20 minutos (como es el caso de los métodos del efecto Kautsky ^[29] ) y al ser capaces de excitar la muestra desde una distancia considerable, los sensores LIF pueden proporcionar una evaluación rápida y remota.

• La aplicación de la técnica LIF a la evaluación del estrés por sequía en el alcornoque ( Quercus suber ) y el pino marítimo ( Pinus pinaster ) sobre la base de la relación de emisión de clorofila I ₆₈₅ / I ₇₄₀ se describe en la Ref. ^[30] Recientemente, la técnica de detección LIF se aprovechó para abordar el papel de la proteína pPLAIIα en la protección del metabolismo fotosintético durante el estrés por sequía utilizando plantas de Arabidopsis modificadas genéticamente. ^[31]

• En 2011, Vieira et al. aplicaron un sensor LIF compacto y de bajo costo ^[32] (construido alrededor de un láser Nd:YAG Q-switched de estado sólido de frecuencia duplicada y un espectrómetro de fibra óptica en miniatura comercial especialmente modificado Ocean Optics USB4000) para estudiar las comunidades microfitobentos intermareales. La emisión de clorofila permitió a los investigadores evaluar adecuadamente la biomasa superficial y rastrear los ritmos migratorios de las microalgas bentónicas epipélicas en sedimentos fangosos. ^[33]

Véase también

• Fluorómetro integrado para el intercambio de gases y la fluorescencia de la clorofila en las hojas.
• Extinción no fotoquímica

Notas

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3. Zhu, XG.; Govindjee, Baker NR; Ort, DR; Long, SP (2005). "Cinética de inducción de fluorescencia de clorofila a en hojas predicha a partir de un modelo que describe cada paso discreto de energía de excitación y transferencia de electrones asociada con el fotosistema II". Planta . 223 (1): 114–133. doi :10.1007/s00425-005-0064-4. PMID  16411287. S2CID  9698923.
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Enlaces externos

• Fluorescencia inducida por el sol, geog.ucl.ac.uk
• Fluorímetro de clorofila de excitación continua avanzado, nutechintl.com

Referencias

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