Fluorescencia de clorofila

Luz reemitida por las moléculas de clorofila durante el regreso de estados excitados a no excitados.

Un extracto de clorofila en alcohol mostrado bajo luz blanca (arriba) y luz ultravioleta que induce fluorescencia (abajo).

Imágenes de microscopio confocal de una hoja de tomate de Solanum lycopersicum . Imagen de campo claro del DIC que muestra celdas de guardia y celdas del pavimento (arriba). La misma región muestra autofluorescencia de clorofila A con excitación láser de 440 nm y emisión de rojo lejano (abajo).

Imágenes microscópicas de una hoja de musgo de Plagiomnium undulatum . Microscopía de campo brillante en la parte superior y microscopía de fluorescencia en la parte inferior. La fluorescencia roja proviene de la clorofila en los cloroplastos.

La fluorescencia de la clorofila es luz reemitida por las moléculas de clorofila durante el retorno de estados excitados a no excitados . Se utiliza como indicador de la conversión de energía fotosintética en plantas , algas y bacterias . La clorofila excitada disipa la energía luminosa absorbida impulsando la fotosíntesis (conversión de energía fotoquímica), como calor en extinción no fotoquímica o mediante emisión como radiación fluorescente. Como estos procesos son complementarios, el análisis de la fluorescencia de la clorofila es una herramienta importante en la investigación de plantas con un amplio espectro de aplicaciones. ^{[1] [2]}

El efecto Kautsky

Tras la iluminación de una hoja adaptada a la oscuridad, se produce un rápido aumento de la fluorescencia del Fotosistema II (PSII), seguido de una lenta disminución. Observado por primera vez por Kautsky et al., 1932 , esto se llama efecto Kautsky. Este aumento variable en la fluorescencia de la clorofila se debe al fotosistema II. ^[3] La fluorescencia del fotosistema I no es variable, sino constante. ^[3]

El aumento de la fluorescencia se debe a que los centros de reacción del PSII se encuentran en un estado "cerrado" o químicamente reducido. ^[4] Los centros de reacción están "cerrados" cuando no pueden aceptar más electrones. Esto ocurre cuando los aceptores de electrones aguas abajo del PSII aún no han pasado sus electrones a un portador de electrones posterior, por lo que no pueden aceptar otro electrón. Los centros de reacción cerrados reducen la eficiencia fotoquímica general y, por tanto, aumentan el nivel de fluorescencia. Transferir una hoja de la oscuridad a la luz aumenta la proporción de centros de reacción de PSII cerrados, por lo que los niveles de fluorescencia aumentan durante 1 a 2 segundos. Posteriormente, la fluorescencia disminuye al cabo de unos minutos. Esto es debido a; 1. más "extinción fotoquímica" en la que los electrones son transportados fuera del PSII debido a enzimas involucradas en la fijación de carbono; y 2. más "enfriamiento no fotoquímico" en el que se convierte más energía en calor.

Medición de fluorescencia

Generalmente la medición inicial es el nivel mínimo de fluorescencia . Esta es la fluorescencia en ausencia de luz fotosintética. ^[5] ${\displaystyle \,F_{0}}$

Para utilizar mediciones de fluorescencia de clorofila para analizar la fotosíntesis, los investigadores deben distinguir entre extinción fotoquímica y extinción no fotoquímica (disipación de calor). Esto se logra deteniendo la fotoquímica, lo que permite a los investigadores medir la fluorescencia en presencia únicamente de extinción no fotoquímica. Para reducir el enfriamiento fotoquímico a niveles insignificantes, se aplica a la hoja un breve destello de luz de alta intensidad. Esto cierra transitoriamente todos los centros de reacción del PSII, lo que evita que la energía del PSII pase a los portadores de electrones posteriores. El enfriamiento no fotoquímico no se verá afectado si el destello es breve. Durante el destello, la fluorescencia alcanza el nivel alcanzado en ausencia de cualquier extinción fotoquímica, conocido como fluorescencia máxima . ^[5] ${\displaystyle \,F_{m}}$

La eficiencia de la extinción fotoquímica (que es un indicador de la eficiencia del PSII) se puede estimar comparándola con el rendimiento constante de fluorescencia en la luz y el rendimiento de fluorescencia en ausencia de luz fotosintética . La eficiencia del enfriamiento no fotoquímico se ve alterada por varios factores internos y externos. Las alteraciones en la disipación de calor significan cambios en . La disipación de calor no se puede detener por completo, por lo que no se puede medir el rendimiento de la fluorescencia de la clorofila en ausencia de extinción no fotoquímica. Por lo tanto, los investigadores utilizan un punto adaptado a la oscuridad ( ) con el que comparar estimaciones de extinción no fotoquímica. ^[5] ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{t}}$ ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle F_{m}^{0}}$

Parámetros de fluorescencia comunes

${\displaystyle \,F_{0}}$: Fluorescencia mínima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de una muestra adaptada a la oscuridad cuando todos los centros de reacción del fotosistema II están abiertos.

${\displaystyle \,F_{m}}$: Fluorescencia máxima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de una muestra adaptada a la oscuridad cuando se ha aplicado un pulso de alta intensidad. Todos los centros de reacción del fotosistema II están cerrados.

${\displaystyle \,{F_{0}}'}$: Fluorescencia mínima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de la muestra adaptada a la luz cuando todos los centros de reacción del fotosistema II están abiertos; se reduce con respecto al enfriamiento no fotoquímico. ${\displaystyle \,F_{0}}$

${\displaystyle \,{F_{m}}'}$: Fluorescencia máxima (unidades arbitrarias). Nivel de fluorescencia de una muestra adaptada a la luz cuando se ha aplicado un pulso de alta intensidad. Todos los centros de reacción del fotosistema II están cerrados.

${\displaystyle \,F_{t}}$: Fluorescencia terminal en estado estacionario (unidades arbitrarias). Un nivel de fluorescencia en estado estacionario disminuyó (= se extinguió) mediante procesos fotoquímicos y no fotoquímicos.

${\displaystyle \,T_{1/2}}$: Tiempo de subida medio de a . ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$

Parámetros calculados

${\displaystyle \,F_{v}}$es fluorescencia variable. Calculado como = - . ^[6] ${\displaystyle \,F_{v}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{0}}$

${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$es la relación entre fluorescencia variable y fluorescencia máxima. Calculado como . ^[7] Esta es una medida de la eficiencia máxima del PSII (la eficiencia si todos los centros del PSII estuvieran abiertos). se puede utilizar para estimar la eficiencia potencial de PSII tomando mediciones adaptadas a la oscuridad. ${\displaystyle {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m}}}}$ ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

${\displaystyle \,\Phi _{PSII}}$Mide la eficiencia del Fotosistema II. Calculado como = . ^[8] Este parámetro mide la proporción de luz absorbida por PSII que se utiliza en fotoquímica. Como tal, puede dar una medida de la tasa de transporte lineal de electrones y, por tanto, indica la fotosíntesis general. ${\displaystyle \,Y_{(II)}}$ ${\displaystyle {\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'}}}$

${\displaystyle \,qP}$(enfriamiento fotoquímico). Calculado como . ^[9] Este parámetro se aproxima a la proporción de centros de reacción de PSII que están abiertos. ${\displaystyle \,{\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}}$

Mientras que da una estimación de la eficiencia y nos dice qué procesos han alterado la eficiencia. El cierre de los centros de reacción como resultado de una luz de alta intensidad alterará el valor de . Los cambios en la eficiencia del enfriamiento no fotoquímico alterarán la proporción . ${\displaystyle \,\Phi _{PSII}}$ ${\displaystyle \,qP}$ ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$ ${\displaystyle \,qP}$ ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

Aplicaciones de la teoría

Rendimiento de PSII como medida de la fotosíntesis.

La fluorescencia de la clorofila parece ser una medida de la fotosíntesis, pero esto es una simplificación excesiva. La fluorescencia puede medir la eficiencia de la fotoquímica PSII, que puede usarse para estimar la tasa de transporte lineal de electrones multiplicándola por la intensidad de la luz. Sin embargo, los investigadores generalmente se refieren a la fijación de carbono cuando se refieren a la fotosíntesis. El transporte de electrones y la fijación de CO ₂ pueden correlacionarse bien, pero es posible que no se correlacionen en el campo debido a procesos como la fotorrespiración, el metabolismo del nitrógeno y la reacción de Mehler .

Relacionando el transporte de electrones con la fijación de carbono.

Una poderosa técnica de investigación consiste en medir simultáneamente la fluorescencia de la clorofila y el intercambio de gases para obtener una imagen completa de la respuesta de las plantas a su entorno. Una técnica consiste en medir simultáneamente la fijación de CO ₂ y la fotoquímica de PSII a diferentes intensidades de luz, en condiciones no fotorrespiratorias. Un gráfico de fijación de CO ₂ y fotoquímica de PSII indica el requerimiento de electrones por molécula de CO ₂ fijada. A partir de esta estimación, se puede estimar el grado de fotorrespiración . Esto se ha utilizado para explorar la importancia de la fotorrespiración como mecanismo fotoprotector durante la sequía.

El análisis de fluorescencia también se puede aplicar para comprender los efectos de las temperaturas altas y bajas.

• Sobrado (2008) ^[10] investigó el intercambio de gases y las respuestas de fluorescencia de la clorofila a a luz de alta intensidad, de especies pioneras y forestales. El intercambio de gases foliares al mediodía se midió utilizando un sistema de fotosíntesis , que midió la tasa fotosintética neta, gs y la concentración de CO ₂ intercelular ( ). En las mismas hojas utilizadas para las mediciones de intercambio de gases, los parámetros de fluorescencia de la clorofila a (inicial, máxima, y ​​variable ) se midieron utilizando un fluorómetro. Los resultados mostraron que, a pesar de que las especies pioneras y las especies forestales ocupaban hábitats diferentes, ambas mostraban una vulnerabilidad similar a la fotoinhibición del mediodía en las hojas expuestas al sol. ${\displaystyle C_{i}}$ ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{v}}$

Medición del estrés y la tolerancia al estrés.

La fluorescencia de la clorofila puede medir la mayoría de los tipos de estrés de las plantas . La fluorescencia de la clorofila se puede utilizar como indicador del estrés de las plantas porque el estrés ambiental, por ejemplo, temperaturas extremas, luz y disponibilidad de agua, puede reducir la capacidad de una planta para metabolizar normalmente. Esto puede significar un desequilibrio entre la absorción de energía luminosa por la clorofila y el uso de energía en la fotosíntesis. ^[11]

• Favaretto et al. (2010) ^[12] investigaron la adaptación a un entorno de luz intensa en especies pioneras y de sucesión tardía, cultivadas con 100% y 10% de luz. Se midieron numerosos parámetros, incluida la fluorescencia de la clorofila a . Se observó una mayor disminución de la exposición a pleno sol en las especies de sucesión tardía que en las especies pioneras. En general, sus resultados muestran que las especies pioneras se desempeñan mejor bajo luz solar intensa que las especies de sucesión tardía, lo que sugiere que las plantas pioneras tienen una mayor tolerancia potencial al daño fotooxidativo. ${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

• Neocleous y Vasilakakis (2009) ^[6] investigaron la respuesta de la frambuesa al estrés por boro y sal . Se utilizó un fluorómetro de clorofila para medir , y . La fluorescencia de la clorofila de la hoja no se vio afectada significativamente por la concentración de NaCl cuando la concentración de B era baja. Cuando se aumentó B, la fluorescencia de la clorofila de las hojas se redujo en condiciones salinas. Se podría concluir que el efecto combinado de B y NaCl sobre las frambuesas induce un efecto tóxico en los parámetros fotoquímicos. ${\displaystyle \,F_{0}}$ ${\displaystyle \,F_{m}}$ ${\displaystyle \,F_{v}}$
• Lu y Zhang (1999) estudiaron el estrés por calor en plantas de trigo y encontraron que la estabilidad de la temperatura en el Fotosistema II de las hojas con estrés hídrico se correlaciona positivamente con la resistencia en el metabolismo durante la fotosíntesis. ^[13]

Índice de equilibrio de nitrógeno

Ejemplo de fluorómetro multiparamétrico portátil que utiliza la relación entre clorofila y flavonoles para detectar la deficiencia de nitrógeno de las plantas

Debido al vínculo entre el contenido de clorofila y el contenido de nitrógeno en las hojas, los fluorómetros de clorofila se pueden utilizar para detectar la deficiencia de nitrógeno en las plantas mediante varios métodos .

Según varios años de investigación y experimentación, los polifenoles pueden ser indicadores del estado de nitrógeno de una planta. Por ejemplo, cuando una planta se encuentra en condiciones óptimas, favorece su metabolismo primario y sintetiza las proteínas (moléculas de nitrógeno) que contienen clorofila y pocos flavonoles (compuestos secundarios a base de carbono). Por otro lado, en caso de falta de nitrógeno, observaremos una mayor producción de flavonoles por parte de la planta. ^[14]

El NBI (Índice de Balance de Nitrógeno) de Force-A, permite evaluar las condiciones de nitrógeno de un cultivo calculando la relación entre Clorofila y Flavonoles (relacionada con la asignación de Nitrógeno/Carbono).

Medir el contenido de clorofila

Gitelson (1999) afirma: "Se encontró que la relación entre la fluorescencia de la clorofila a 735 nm y el rango de longitud de onda de 700 nm a 710 nm, F735/F700, es linealmente proporcional al contenido de clorofila (con un coeficiente de determinación, r2, superior a 0,95) y, por tanto, Esta proporción puede usarse como un indicador preciso del contenido de clorofila en las hojas de las plantas". ^[15]

Fluorómetros de clorofila

Imagen de fluorescencia (valor Ft) de la superficie de la hoja adaxial.

El desarrollo de fluorómetros permitió que el análisis de fluorescencia de clorofila se convirtiera en un método común en la investigación de plantas. El análisis de fluorescencia de clorofila ha sido revolucionado por la invención de la técnica de modulación de amplitud de pulso (PAM) ^{[16] [17]} y la disponibilidad del primer fluorómetro de clorofila modulado comercial PAM-101 (Walz, Alemania). Modulando el haz de luz de medición (pulsos en el rango de microsegundos) y detectando en paralelo la fluorescencia excitada se puede determinar el rendimiento relativo de fluorescencia (Ft) en presencia de luz ambiental. Fundamentalmente, esto significa que la fluorescencia de la clorofila se puede medir en el campo incluso a plena luz del sol. ^[5]

Hoy en día, los fluorómetros de clorofila están diseñados para medir muchos mecanismos diferentes de las plantas. Los protocolos de medición: F _V /F _M y OJIP miden la eficiencia de las muestras del Fotosistema II en un estado adaptado a la oscuridad común y conocido. Estos protocolos son útiles para medir muchos tipos de estrés en las plantas. ^[18] El protocolo de medición adaptado a la luz de Bernard Genty ΔF/F _M ', o Y(II), es una forma eficaz y sensible de medir muestras de plantas en condiciones de iluminación ambiental o artificial. ^[19] Sin embargo, dado que los valores de Y(II) también cambian con la intensidad de la luz, se deben comparar muestras con la misma intensidad de luz, a menos que el foco de la medición sea el estrés lumínico. Y(II) puede ser más sensible a algunos tipos de estrés de las plantas que F _V /F _M , como el estrés por calor. ^[20]

También se han desarrollado otros protocolos de medición de mecanismos de la planta. Cuando un cloroplasto absorbe luz, parte de la energía luminosa se destina a la fotoquímica, otra parte a la disipación de calor regulada y otra parte a la disipación de calor no regulada. ^[21] Existen varios parámetros de medición de la fluorescencia de la clorofila para medir todos estos eventos. En el modelo del lago, q _L mide el enfriamiento fotoquímico, Y(NYO) mide la disipación de calor regulada por la planta e Y(NO) mide la disipación de calor no regulada. ^[21] Un protocolo de enfriamiento más antiguo, llamado modelo de charco, utiliza q _P para el enfriamiento fotoquímico, q _N para el enfriamiento no fotoquímico de la disipación de calor regulada y no regulada y NPQ para una estimación del enfriamiento no fotoquímico. ^[22] NPQ también ha resucitado matemáticamente al modelo del lago. ^[23]

Además, se han desarrollado los parámetros q _{E y pNPQ para medir el ciclo fotoprotector de las xantofilas.} ^{[24] [25]} q _T es una medida de las transiciones de estado. ^[26] q _M es una medida de la migración de cloroplastos, ^[27] y q _I es una medida de la fotoinhibición de las plantas. ^[28]

En niveles de luz actínica más bajos NPQ = qE+qT+qI ^[24]

A altos niveles de luz actínica NPQ = qE+qM=qI ^[27]

Algunos fluorómetros están diseñados para ser portátiles y operarse con una mano.

El desarrollo constante de fluorómetros de imágenes facilita la visualización de heterogeneidades espaciales en la actividad fotosintética de las muestras. Estas heterogeneidades ocurren naturalmente en las hojas de las plantas, por ejemplo durante el crecimiento, diversas tensiones ambientales o infecciones por patógenos. Por lo tanto, el conocimiento sobre las heterogeneidades de las muestras es importante para la interpretación correcta del desempeño fotosintético de la muestra de planta. Los sistemas de fluorómetro de imágenes de alto rendimiento brindan opciones para analizar una sola célula/cloroplasto, así como áreas de muestra que cubren hojas o plantas enteras.

Aproximaciones alternativas

sensores LIF

Las técnicas basadas en el efecto Kautsky no agotan la variedad de métodos de detección y evaluación basados ​​en la fluorescencia de la clorofila. En particular, los avances recientes en el área de la fluorescencia inducida por láser (LIF) también brindan la oportunidad de desarrollar sensores suficientemente compactos y eficientes para evaluaciones del estado fotofisiológico y de la biomasa. En lugar de medir la evolución del flujo de fluorescencia total, estos sensores registran la densidad espectral de este flujo excitado por fuertes pulsos de luz láser monocromática de nanosegundos de duración. Al no requerir un período de adaptación a la oscuridad de 15 a 20 minutos (como es el caso de los métodos del efecto Kautsky ^[29] ) y al ser capaces de excitar la muestra desde una distancia considerable, los sensores LIF pueden proporcionar una evaluación rápida y remota.

• La aplicación de la técnica LIF a la evaluación del estrés por sequía en el alcornoque ( Quercus suber ) y el pino marítimo ( Pinus pinaster ) sobre la base de la relación de emisión de clorofila I ₆₈₅ / I ₇₄₀ se describe en la Ref. ^[30] Recientemente, se aprovechó la técnica de detección de LIF para abordar el papel de la proteína pPLAIIα en la protección del metabolismo fotosintético durante el estrés por sequía utilizando plantas de Arabidopsis modificadas genéticamente. ^[31]

• En 2011, Vieira et al. aplicaron un sensor LIF compacto de bajo costo ^[32] (construido alrededor de un láser Nd:YAG de estado sólido con conmutación Q de frecuencia duplicada y un espectrómetro de fibra óptica en miniatura comercial especialmente modificado Ocean Optics USB4000) para estudiar las comunidades de microfitobentos intermareales. La emisión de clorofila permitió a los investigadores evaluar adecuadamente la biomasa superficial y rastrear los ritmos migratorios de las microalgas bentónicas epipélicas en sedimentos fangosos. ^[33]

Ver también

• Fluorómetro integrado para intercambio de gases y fluorescencia de clorofila de hojas.
• Temple no fotoquímico

Notas

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enlaces externos

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• Fluorímetro de clorofila de excitación continua avanzado, nutechintl.com

Referencias

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