Los modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer son modelos de organismos o células que se utilizan en la investigación para investigar cuestiones biológicas sobre la enfermedad de Alzheimer , así como para desarrollar y probar nuevos tratamientos terapéuticos. La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo progresivo asociado con el envejecimiento, que se presenta tanto de forma esporádica (la forma más común de diagnóstico) como debido a mutaciones hereditarias en genes asociados con la patología de Alzheimer. [1] [2] Los síntomas comunes asociados con la enfermedad de Alzheimer incluyen: pérdida de memoria , confusión y cambios de humor. [3]
Como la enfermedad de Alzheimer afecta a alrededor de 55 millones de pacientes en todo el mundo y representa aproximadamente el 60-70% de todos los casos de demencia, se gastan miles de millones de dólares anualmente en investigación para comprender mejor los mecanismos biológicos de la enfermedad, así como para desarrollar tratamientos terapéuticos efectivos para ella. [2] [4] Los investigadores suelen utilizar tejido humano post-mortem o modelos experimentales para realizar experimentos relacionados con la enfermedad de Alzheimer. [5] Los modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer son particularmente útiles ya que permiten la manipulación compleja de sistemas biológicos para dilucidar preguntas sobre la enfermedad de Alzheimer sin el riesgo de dañar a los humanos. Estos modelos a menudo tienen modificaciones genéticas que les permiten ser más representativos de la enfermedad de Alzheimer humana y su patología asociada: placas extracelulares de beta amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares (NFT). [6] Los métodos actuales utilizados por los investigadores son: cultivo celular tradicional en 2D , cultivo celular en 3D , sistemas microfisiológicos y modelos animales .
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El cultivo celular bidimensional tradicional es un modelo experimental útil de la enfermedad de Alzheimer para realizar experimentos de alto rendimiento. Estos cultivos se realizan en una placa o matraz en una monocapa y pueden estar compuestos por un solo tipo de célula o por múltiples tipos de células. [7] Los cultivos 2D a menudo tienen dificultades para producir placas insolubles de amiloide-β incluso cuando pueden secretar el péptido amiloide-β. [8] [9] Los tipos comunes de cultivo celular 2D utilizados para modelar la enfermedad de Alzheimer son las líneas celulares inmortalizadas , los cultivos de neuronas primarias y las células madre pluripotentes inducidas derivadas del paciente (iPSC).
Las líneas celulares inmortalizadas son células de un organismo que han sido manipuladas genéticamente para que puedan proliferar in vitro, lo que las convierte en una herramienta útil para los investigadores, ya que pueden hacerlo rápidamente, lo que permite una experimentación de alto rendimiento. Estas mutaciones pueden ocurrir a partir de una mutación causada naturalmente, como las que se encuentran en las células cancerosas, o al ser introducidas por investigadores. Las líneas celulares inmortalizadas comunes que se utilizan para estudiar la enfermedad de Alzheimer incluyen: riñón embrionario humano 293 (HEK293), neuroblastoma humano (SH-SY5Y), neuroglioma humano (H4), mesencefálico embrionario humano (LUHMES), progenitor neural humano (ReN) y células de feocromocitoma (PC12). [10] Estos tipos de células están disponibles comercialmente, son relativamente económicas y fáciles de cultivar y mantener. [10] [11] Los compuestos pro-muerte se pueden utilizar en estos modelos para inducir la muerte celular relacionada con la enfermedad de Alzheimer. Estos compuestos incluyen: amiloide-β 42, proteína tau, ácido glutámico [12] y compuestos oxidativos/proinflamatorios. [13]
Los cultivos de neuronas primarias se generan a partir de tejido cerebral de roedores embrionarios o posnatales y se cultivan en placas. [14] Las regiones cerebrales comunes utilizadas para cultivos para estudiar la enfermedad de Alzheimer incluyen el hipocampo , la corteza y la amígdala ; sin embargo, cualquier región cerebral es adecuada para cultivos. [7] Este método requiere la disección de la región cerebral deseada del tejido de roedores seguida de pasos de digestión, disociación y siembra. [14] Como estos cultivos se derivan directamente del tejido cerebral de roedores, se parecen morfológica y fisiológicamente a las células cerebrales humanas, contienen múltiples tipos de células neuronales y no proliferan. [10] Cuando se cultivan inicialmente, estas células son esféricas y con el tiempo comienzan a formar axones , dendritas y eventualmente desarrollan conexiones sinápticas . [14]
Las líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes son únicas en las que las células somáticas diferenciadas se toman de pacientes con enfermedad de Alzheimer y se revierten en células madre pluripotentes a través de un cóctel de factores transcripcionales ectópicos "Tamanaka". [11] Estas células madre pueden luego ser dirigidas para diferenciarse en muchos tipos de células, incluyendo neuronas, astrocitos , microglia , oligodendrocitos , pericitos y células endoteliales . [5] [11] Esto permite que estos modelos se generen tanto a partir de pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar (FAD) de inicio temprano con mutaciones en los genes APP , PSEN1 o PSEN2 , así como pacientes con enfermedad de Alzheimer (SAD) de inicio tardío/esporádico, una población que no se replica por completo en modelos animales. Como SAD es la forma de EA más comúnmente diagnosticada, esto destaca a las iPSC como herramientas clave para comprender esta forma de la enfermedad. [5] Estas células también se pueden comprar comercialmente. [15] [16] La tecnología CRISPR-Cas9 se puede utilizar junto con células iPSC para generar neuronas que portan múltiples mutaciones FAD. [5] [10] Una de las principales desventajas de estos modelos es que pueden parecerse inadecuadamente a las neuronas maduras, además de ser más caros y difíciles de mantener. [11] También se ha demostrado que las iPSC presentan inestabilidad genómica y desarrollan mutaciones adicionales cuando se las pasa (se las recolecta y se las vuelve a sembrar en cultivos hijos) numerosas veces, lo que plantea problemas de seguridad para el uso en pacientes y posibles problemas de reproducibilidad en estudios experimentales. [5] Debido a la naturaleza de los procedimientos de reprogramación, las células iPSC pierden las firmas celulares y epigenéticas adquiridas por el envejecimiento y los factores ambientales, lo que limita la capacidad de las iPSC para recapitular enfermedades asociadas con el envejecimiento, como la enfermedad de Alzheimer. Si bien estos cultivos tienen algunas limitaciones, se han dilucidado muchos descubrimientos fundamentales sobre la biología de la enfermedad de Alzheimer utilizando este sistema modelo. [ cita requerida ]
Los métodos de cultivo de organoides tridimensionales se han convertido en una forma popular de recapitular la patología de la EA en un entorno más "similar al cerebro" que el cultivo 2D tradicional, ya que crean una estructura organizada similar a la de la corteza humana. [10] [24] Esto ha demostrado ser eficaz específicamente para modelar la enfermedad de Alzheimer, ya que los cultivos 2D tienden a fallar en la producción de amiloide-β insoluble, mientras que los modelos de cultivo 3D sí pueden. [8] Estos modelos consisten en múltiples tipos de células neuronales cocultivadas juntas en matrices artificiales que permiten comprender cómo las células no neuronales y la neuroinflamación influyen en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. [11] Los tipos de células neuronales expresados en estos modelos a menudo incluyen neuronas , astrocitos , microglia , oligodendrocitos , células epiteliales y endoteliales . [9] [11] Estos organoides se desarrollan durante muchos meses para mostrar la patología de Alzheimer y se pueden mantener durante largos períodos de tiempo. [5] [9] Pueden derivarse tanto de iPSC como de células indiferenciadas inmortalizadas y típicamente alcanzan un diámetro de varios milímetros. [9] [24] Los cultivos 3D pueden autoorganizarse o pueden colocarse bajo formación guiada en la que factores exógenos influyen en el patrón de diferenciación del organoide. [9] Los métodos de cultivo 3D han mostrado una agregación de amiloide-β más robusta, acumulación de tau fosforilada y anomalías endosómicas que los métodos de cultivo 2D de las mismas líneas celulares, lo que indica una patología acelerada. [5] [24]
Los problemas comunes que surgen del uso de cultivos 3D son la falta de vasculatura dentro del organoide, lo que lleva a la muerte celular y disfunción en las capas internas. [5] [9] Los esfuerzos actuales [ ¿cuándo? ] se centran en la introducción de células endoteliales en cultivos de formación guiada para crear sistemas vasculares y proporcionar distribución de nutrientes a las capas profundas. [5] [9] Los organoides autoorganizados también varían en términos de proporción y ubicación de las células expresadas, lo que provoca desafíos en la reproducibilidad de los experimentos. [9] Se ha puesto más esfuerzo en los organoides de formación guiada para tener en cuenta este problema, sin embargo, este método requiere más tiempo y es difícil de optimizar. [9] La capacidad del cultivo de organoides 3D para parecerse a fenotipos envejecidos también es limitada, ya que muchos métodos de organoides se basan en iPSC que son más similares a las células cerebrales prenatales debido a los protocolos de reprogramación. [9] Los investigadores están actualmente [ ¿ cuándo? ] ] investigando perfiles transcripcionales comunes asociados con la enfermedad de Alzheimer y el envejecimiento con el fin de reintroducir estos paisajes en iPSC para futuras investigaciones biomédicas y desarrollo terapéutico. [ cita requerida ]
Los sistemas microfisiológicos neuronales, también conocidos como " cerebro en un chip ", son una combinación de cultivos 3D y una plataforma de microfluidos , que hace circular el medio proporcionado a las células cultivadas. [10] Estos dispositivos son beneficiosos ya que mejoran la viabilidad celular y modelan mejor las condiciones fisiológicas, ya que mejoran la disponibilidad de oxígeno y el suministro de nutrientes a las capas internas de los cultivos 3D. [9] [25] Estos sistemas introducen además señales fisiológicas como la tensión, la compresión y la tensión de cizallamiento del fluido, lo que permite que estas condiciones in vitro se asemejen mejor al entorno in vivo. [8] Se ha demostrado que los sistemas microfisiológicos replican la agregación de amiloide-β, la tau hiperfosforilada y la neuroinflamación, además de mostrar el reclutamiento microglial, la liberación de citocinas y quimiocinas y la activación neurotóxica microglial como respuesta a interacciones célula-célula más relevantes desde el punto de vista fisiológico. [10] Estos sistemas también pueden desarrollarse incorporando células endoteliales cerebrales para imitar la barrera hematoencefálica , lo que lo convierte en un modelo extremadamente útil para la disfunción de la BHE en la enfermedad de Alzheimer, la detección de nuevas terapias que podrían pasar de la sangre al cerebro, la farmacocinética terapéutica , así como las tendencias de adsorción, distribución, metabolismo, eliminación y toxicidad de fármacos (ADMET). [8] [10] [25]
Los modelos animales de roedores de la enfermedad de Alzheimer se utilizan comúnmente en la investigación, ya que los roedores y los humanos tienen muchas de las mismas regiones cerebrales y sistemas de neurotransmisores principales. [5] Estos modelos son pequeños, fáciles de albergar y se reproducen muy bien. [26] Los ratones y las ratas en promedio tienden a vivir dos años, una vida útil mucho más corta que los humanos, lo que presenta tanto limitaciones como beneficios para completar más rápidamente el experimento. [5]
Para recapitular y acelerar la patología de la enfermedad de Alzheimer humana, los científicos introducen comúnmente mutaciones asociadas a FAD . [27] Los genes comunes objetivo de la ingeniería genética en modelos animales son APP , MAPT , PSEN1 , PSEN2 y APOE . [6] Esto da como resultado que los modelos animales tengan una mayor tendencia a formar placas de amiloide-β y/o ovillos neurofibrilares, las dos características patológicas de la enfermedad de Alzheimer. [6] Estos genes mutados pueden sobreexpresarse (modelos de primera generación) o expresarse a niveles endógenos (modelos de segunda generación) como una forma de replicar aún más la patología de la enfermedad. [6] Los científicos también sobreexpresan genes humanos no mutados con la esperanza de ver una patología similar a la de la enfermedad de Alzheimer. [28] Estas mutaciones introducidas o la sobreexpresión de genes humanos asociados al Alzheimer pueden llevar a que estos animales muestren adicionalmente deterioro cognitivo, déficits en la potenciación a largo plazo (LTP), pérdida sináptica, gliosis y pérdida neuronal. Como los modelos actuales dependen en gran medida de las mutaciones de FAD para inducir una patología similar a la del Alzheimer, aún no existe un modelo ideal que replique completamente la SAD (enfermedad de Alzheimer esporádica), que es el tipo de diagnóstico más común en los pacientes. [29]
Los métodos comunes utilizados para generar estas líneas son el uso de transgenes controlados por un promotor específico, la recombinación Cre-Lox y el sistema CRISPR-Cas9 . Los científicos también pueden utilizar métodos de inyección como la inyección intracerebroventricular, [30] la inyección intravenosa, [31] [32] o la inyección intrahipocampal [33] para modificar roedores de tipo salvaje para que muestren la patología de la enfermedad de Alzheimer. Estos modelos de roedores se utilizan a menudo para probar y desarrollar medicamentos para tratar la enfermedad de Alzheimer antes de avanzar a los ensayos clínicos en humanos. [ cita requerida ]
Los investigadores pueden utilizar primates no humanos para estudiar los mecanismos de la enfermedad de Alzheimer, así como para desarrollar terapias. Los primates no humanos son útiles ya que tienen un patrón de envejecimiento más similar al de los humanos en comparación con los modelos de roedores. [60] Durante el envejecimiento de los primates no humanos, pueden mostrar neuropatía, cambios cognitivos y depósitos de amiloide-β, similares a los de la enfermedad de Alzheimer. [60] Si bien estos modelos son útiles para estudiar el proceso de envejecimiento, no siempre son modelos exactos de la enfermedad de Alzheimer. Los primates no humanos comunes utilizados en la investigación de la EA incluyen: monos rhesus ( Macaca mulattas ), macacos de cola corta ( Macaca arctoides ), lémures ratón ( Microcebus murinus ), el tití común ( Callithrix jacchus ) y macacos cangrejeros ( Macaca fascicularis ). [60] Estos modelos pueden estudiarse tanto de forma espontánea como a través de la inducción artificial de respuestas de la enfermedad de Alzheimer. [60] Las técnicas comunes utilizadas para inducir estos modelos incluyen: lesión del sistema nervioso colinérgico, inyección de amiloide-β, formaldehído intrínseco y estreptozotocina (un compuesto de azúcar metilnitrosourea que induce diabetes) . [60]