El etiquetado isobárico es una estrategia de espectrometría de masas utilizada en proteómica cuantitativa . Los péptidos o proteínas se etiquetan con grupos químicos que tienen masa nominalmente idéntica (isobáricos), pero varían en términos de distribución de isótopos pesados en su estructura. Estas etiquetas, comúnmente denominadas etiquetas de masa en tándem , están diseñadas de modo que la etiqueta de masa se escinda en una región de enlace específica tras una disociación inducida por colisión de alta energía (HCD) durante la espectrometría de masas en tándem , lo que produce iones indicadores de diferentes masas.
Las etiquetas isobáricas más comunes son las etiquetas reactivas a aminas. [1] Sin embargo, también se han descrito etiquetas que reaccionan con residuos de cisteína y grupos carbonilo. [2] Estos grupos reactivos a aminas pasan por reacciones de N-hidroxisuccinimida (NHS) , que se basan en tres tipos de grupos funcionales. [2] Los métodos de etiquetado isobárico incluyen etiquetas de masa en tándem (TMT) , etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) , etiquetas diferenciales de masa para cuantificación absoluta y relativa y etiquetado con dimetilo. [1] Los métodos TMT e iTRAQ son los más comunes y desarrollados de estos métodos. [1] Las etiquetas de masa en tándem tienen una región indicadora de masa, una región de enlace escindible, una región de normalización de masa y un grupo reactivo a proteínas y tienen la misma masa total. [3]
Un flujo de trabajo proteómico ascendente típico se describe en (Yates, 2014). [2] Las muestras de proteínas son digeridas enzimáticamente por una proteasa para producir péptidos. Cada muestra experimental digerida es derivada con una variante isotópica diferente de la etiqueta de un conjunto. Las muestras se mezclan en proporciones típicamente iguales y se analizan simultáneamente en una ejecución de MS. Dado que las etiquetas son isobáricas y tienen propiedades químicas idénticas, las variantes isotópicas de las etiquetas aparecen como un único pico compuesto en el mismo valor m/z en un escaneo MS1 con tiempos de retención de cromatografía líquida (LC) idénticos. Durante el análisis MS2 y tras la fragmentación, cada variante isotópica de la etiqueta produce iones de producto específicos de la secuencia. Estos iones de producto se utilizan para determinar la secuencia del péptido y las etiquetas indicadoras cuyas abundancias reflejan la proporción relativa del péptido en las muestras que se combinaron. Se requiere el uso de MS/MS para detectar las etiquetas, por lo tanto, los péptidos no marcados no se cuantifican.
Explicado previamente por (Lee, Choe, Aggarwal, 2017). [4] Un beneficio clave del etiquetado isobárico sobre otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, sin etiqueta) es la capacidad de multiplexación y, por lo tanto, el potencial de mayor rendimiento. La capacidad de combinar y analizar varias muestras simultáneamente en una ejecución de LC-MS elimina la necesidad de analizar múltiples conjuntos de datos y elimina la variación de una ejecución a otra. La multiplexación reduce la variabilidad del procesamiento de la muestra, mejora la especificidad al cuantificar los péptidos de cada condición simultáneamente y reduce el tiempo de respuesta para múltiples muestras. Sin la multiplexación, se puede perder información de una ejecución a otra, lo que afecta la identificación y cuantificación, ya que los péptidos seleccionados para la fragmentación en una ejecución de LC-MS/MS pueden no estar presentes o no estar en la cantidad adecuada en ejecuciones de muestras posteriores. Las etiquetas químicas isobáricas disponibles actualmente facilitan el análisis simultáneo de 2 a 11 muestras experimentales.
El etiquetado isobárico se ha utilizado con éxito para muchas aplicaciones biológicas, incluida la identificación y cuantificación de proteínas, el perfil de expresión de proteínas de estados normales frente a anormales, el análisis cuantitativo de proteínas para las que no hay anticuerpos disponibles y la identificación y cuantificación de proteínas modificadas postraduccionalmente. [4]
Existen dos tipos de etiquetas isobáricas disponibles comercialmente: etiquetas de masa en tándem (TMT) y etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) . Las TMT reactivas a aminas están disponibles en conjuntos dúplex, 6-plex y 10-plex y ahora 11-plex. [5] Las iTRAQ reactivas a aminas están disponibles en formas 4-plex y 8-plex [6] .