El marcaje con inmunooro o tinción con inmunooro ( IGS ) es una técnica de tinción que se utiliza en microscopía electrónica . [2] Esta técnica de tinción es un equivalente de la técnica de inmunofluorescencia indirecta para luz visible. Las partículas de oro coloidal suelen estar unidas a anticuerpos secundarios que, a su vez, están unidos a anticuerpos primarios diseñados para unirse a un antígeno específico u otro componente celular . El oro se utiliza por su alta densidad electrónica , que aumenta la dispersión de electrones para dar "puntos oscuros" de alto contraste. [3]
Utilizado por primera vez en 1971, el marcaje con inmunooro se ha aplicado tanto a la microscopía electrónica de transmisión como a la microscopía electrónica de barrido , así como a la microscopía de campo claro . La técnica de marcaje se puede adaptar para distinguir varios objetos mediante el uso de partículas de oro de diferentes tamaños.
El etiquetado con inmunooro puede generar artefactos, ya que las partículas de oro se encuentran a cierta distancia del objeto etiquetado y se requieren cortes muy finos durante la preparación de la muestra. [3]
El marcaje con inmunooro fue utilizado por primera vez en 1971 por Faulk y Taylor para identificar antígenos de Salmonella . [2] [4] Se aplicó por primera vez en microscopía electrónica de transmisión (MET) y fue especialmente útil para resaltar proteínas que se encuentran en densidades bajas, como algunos antígenos de la superficie celular. [5] A medida que aumentó la resolución de la microscopía electrónica de barrido (MEB), también aumentó la necesidad de marcadores del tamaño de nanopartículas como el inmunooro. En 1975, Horisberger y sus colaboradores visualizaron con éxito nanopartículas de oro con un diámetro de menos de 30 nm [6] y esto pronto se convirtió en una técnica de MEB establecida. [5]
En primer lugar, se corta una sección delgada de la muestra, generalmente utilizando un micrótomo . [7] Luego pueden tener lugar otras etapas de preparación de la muestra .
La muestra preparada se incuba luego con un anticuerpo específico diseñado para unirse a la molécula de interés. [3] A continuación, se añade un anticuerpo secundario que tiene partículas de oro adheridas y se une al anticuerpo primario. El oro también se puede unir a la proteína A o a la proteína G en lugar de a un anticuerpo secundario, ya que estas proteínas se unen a las regiones Fc de IgG de mamíferos de una manera no específica. [6]
La partícula de oro densa en electrones ahora puede verse bajo un microscopio electrónico como un punto negro, que marca indirectamente la molécula de interés. [3]
El marcaje con inmunooro se puede utilizar para visualizar más de un objetivo simultáneamente. Esto se puede lograr en la microscopía electrónica utilizando dos partículas de oro de diferentes tamaños. [8] Una extensión de este método utilizó tres partículas de oro de diferentes tamaños para rastrear la localización de los péptidos reguladores . [9] Un método más complejo de marcaje de múltiples sitios implica marcar los lados opuestos de un sitio antigénico por separado, las partículas de inmunooro unidas a ambos lados se pueden ver simultáneamente. [10]
Aunque el marcaje inmuno-oro se utiliza normalmente para la microscopía electrónica de transmisión, cuando el oro está "mejorado con plata" se puede ver utilizando microscopía de campo claro . [11] La mejora con plata aumenta el tamaño de partícula, lo que también hace posible la microscopía electrónica de barrido. Para producir las partículas de oro mejoradas con plata, las partículas de oro coloidal se colocan en una solución de mejora ácida que contiene iones de plata . Las partículas de oro actúan entonces como un sitio de nucleación y la plata se deposita sobre la partícula. Un ejemplo de la aplicación del marcaje inmuno-oro mejorado con plata (IGSS) fue en la identificación del patógeno Erwinia amylovora . [11]
Una limitación inherente a la técnica del inmunooro es que la partícula de oro se encuentra a unos 15-30 nm de distancia del sitio al que se une el anticuerpo primario [5] (cuando se utiliza una estrategia de marcaje de anticuerpos primarios y secundarios ). Por lo tanto, no se puede calcular con precisión la ubicación precisa de la molécula diana. Las partículas de oro se pueden crear con un diámetro de 1 nm (o inferior), pero entonces se advierte otra limitación: en estos tamaños, la etiqueta de oro se vuelve difícil de distinguir de la estructura del tejido. [2] [5]
Para el marcaje con inmunooro se necesitan cortes finos que pueden producir imágenes engañosas; un corte fino de un componente celular puede no dar una visión precisa de su estructura tridimensional . Por ejemplo, un microtúbulo puede aparecer como una "espiga" según el plano en el que se haya realizado el corte. Para superar esta limitación, se pueden tomar cortes seriados que luego se pueden compilar en una imagen tridimensional . [3]
Otra limitación es que los anticuerpos y las partículas de oro no pueden penetrar la resina utilizada para incrustar las muestras para la obtención de imágenes. Por lo tanto, solo se pueden identificar y visualizar las moléculas accesibles. El etiquetado previo a la incrustación de la muestra puede reducir el impacto negativo de esta limitación. [3]