El microscopio electrónico de barrido ambiental ( ESEM ) es un microscopio electrónico de barrido (SEM) que permite la opción de recolectar micrografías electrónicas de muestras que están húmedas , sin recubrimiento o ambas al permitir un entorno gaseoso en la cámara de muestras. Aunque hubo éxitos anteriores en la visualización de muestras húmedas en cámaras internas en SEM modificados, el ESEM con sus detectores de electrones especializados (en lugar del detector Everhart-Thornley estándar ) y sus sistemas de bombeo diferencial, para permitir la transferencia del haz de electrones desde el alto vacío en el área de la pistola a la alta presión alcanzable en su cámara de muestras, lo convierten en un instrumento completo y único diseñado para el propósito de obtener imágenes de muestras en su estado natural. El instrumento fue diseñado originalmente por Gerasimos Danilatos mientras trabajaba en la Universidad de Nueva Gales del Sur .
Comenzando con Manfred von Ardenne , [1] se informaron los primeros intentos del examen de especímenes dentro de celdas "ambientales" con agua o gas atmosférico, junto con microscopios electrónicos de transmisión de barrido y convencionales . [2] [3] [4] [5] Sin embargo, las primeras imágenes de especímenes húmedos en un SEM fueron reportadas por Lane en 1970 [6] cuando inyectó un chorro fino de vapor de agua sobre el punto de observación en la superficie del espécimen; el gas se difundió en el vacío de la cámara del espécimen sin ninguna modificación en el instrumento. Además, Shah y Beckett informaron el uso de celdas o cámaras bombeadas diferencialmente para presumiblemente mantener los especímenes botánicos conductores con el fin de permitir el uso del modo de corriente de espécimen absorbido para la detección de señales en 1977 [7] y en 1979. [8] Spivak et al. En 1977, informaron sobre el diseño y el uso de varias configuraciones de detección de celdas ambientales en un SEM, incluido el bombeo diferencial o el uso de películas transparentes a los electrones para mantener las muestras en su estado húmedo. [9] Esas celdas, por su naturaleza, solo tenían un uso de aplicación limitado y no se realizó ningún desarrollo adicional. En 1974, Robinson [10] informó sobre un enfoque mejorado con el uso de un detector de electrones retrodispersados y bombeo de vacío diferencial con una sola abertura y la introducción de vapor de agua alrededor de 600 Pa de presión en el punto de congelación de la temperatura. Sin embargo, ninguno de esos enfoques produjo un instrumento lo suficientemente estable para el funcionamiento de rutina. Danilatos, que comenzó a trabajar con Robinson en 1978 en la Universidad de Nueva Gales del Sur en Sydney, emprendió un estudio cuantitativo y una experimentación exhaustivos que dieron como resultado un funcionamiento estable del microscopio a temperatura ambiente y altas presiones de hasta 7000 Pa, como se informó en 1979. [11] En los años siguientes, Danilatos, trabajando de forma independiente, informó sobre una serie de trabajos sobre el diseño y la construcción de un microscopio electrónico de barrido ambiental o atmosférico (ASEM) capaz de trabajar a cualquier presión desde el vacío hasta una atmósfera. [12] [13] [14] [15] Estos primeros trabajos implicaron la optimización del sistema de bombeo diferencial junto con detectores de electrones retrodispersados (BSE) hasta 1983, cuando inventó el uso del propio gas ambiental como medio de detección. La década de 1980 se cerró con la publicación de dos importantes trabajos que tratan exhaustivamente los fundamentos del ESEM [16] y la teoría del dispositivo de detección gaseoso (GDD). [17]Además, en 1988, el primer ESEM comercial fue exhibido en Nueva Orleans por ElectroScan Corporation, [18] una compañía de capital de riesgo que deseaba comercializar el ESEM de Danilatos. La compañía puso énfasis en el modo de electrones secundarios (SE) del GDD [19] y aseguró el monopolio del ESEM comercial con una serie de patentes clave adicionales. [20] [21] [22] [23] Las compañías Philips y FEI [24] sucedieron a ElectroScan en el suministro de instrumentos ESEM comerciales. Con la expiración de las patentes clave y la asistencia de Danilatos, LEO [24] agregó más tarde al mercado nuevos instrumentos comerciales (sucedidos por Carl Zeiss SMT ). Hasta la fecha, se han informado más mejoras a partir del trabajo en el prototipo experimental original ESEM en Sydney y de numerosos otros trabajadores que utilizan el ESEM comercial en una amplia variedad de aplicaciones en todo el mundo. En 1993 , Danilatos recopiló una bibliografía completa temprana [25] , mientras que un estudio más reciente se puede encontrar en una tesis doctoral de Morgan (2005). [26]
Un ESEM emplea un haz de electrones escaneado y lentes electromagnéticas para enfocar y dirigir el haz sobre la superficie de la muestra de manera idéntica a un SEM convencional. Un punto de electrones enfocado muy pequeño (sonda) se escanea en forma de trama sobre una pequeña área de la muestra. Los electrones del haz interactúan con la capa superficial de la muestra y producen varias señales (información) que se recogen con detectores apropiados. La salida de estos detectores modula, a través de la electrónica apropiada, la pantalla de un monitor para formar una imagen que corresponde a la pequeña trama y la información, píxel por píxel, que emana de la superficie de la muestra. Más allá de estos principios comunes, el ESEM se desvía sustancialmente de un SEM en varios aspectos, todos los cuales son importantes para el diseño y el funcionamiento correctos del instrumento. El esquema a continuación destaca estos requisitos y cómo funciona el sistema.
La cámara de muestra que sostiene el entorno gaseoso de alta presión está separada del alto vacío de la columna de óptica electrónica con al menos dos pequeños orificios habitualmente denominados aberturas limitadoras de presión (PLA). El gas que se escapa a través de la primera abertura (PLA1) se elimina rápidamente del sistema con una bomba que mantiene una presión mucho más baja en la región aguas abajo (es decir, inmediatamente por encima de la abertura). [14] Esto se llama bombeo diferencial. Parte del gas escapa más allá de la región de baja presión (etapa 1) a través de una segunda abertura limitadora de presión (PLA2) hacia la región de vacío de la columna superior, lo que constituye un bombeo diferencial de segunda etapa (etapa 2). Un diagrama esquemático muestra las etapas básicas de presión de gas ESEM que incluyen la cámara de muestra, la cavidad intermedia y la columna de óptica electrónica superior. [27] Las presiones correspondientes alcanzadas son p 0 >> p 1 >> p 2 , que es una condición suficiente para un microscopio que emplea un cañón de electrones de tipo tungsteno. Se pueden añadir etapas de bombeo adicionales para lograr un vacío aún mayor, como se requiere para un LaB 6 y cañones de electrones de tipo emisión de campo. El diseño y la forma de una abertura limitadora de presión son fundamentales para obtener el gradiente de presión más agudo posible (transición) a través de ella. Esto se logra con un orificio hecho en una placa delgada y afilado en la dirección descendente como se muestra en los contornos de isodensidad adjuntos de un gas que fluye a través del PLA1. Esto se hizo con una simulación por computadora de las colisiones de moléculas de gas y el movimiento a través del espacio en tiempo real. [28] [29] Podemos ver inmediatamente en la figura de los contornos de isodensidad del gas a través de la abertura que la densidad del gas disminuye en aproximadamente dos órdenes de magnitud a lo largo de la longitud de unos pocos radios de abertura. Esta es una demostración cuantitativamente vívida de un primer principio que permite la separación de la cámara de muestra de alta presión de las regiones de baja presión y vacío superiores.
De esta manera, se han estudiado los campos de flujo de gas en una variedad de situaciones instrumentales, [30] en las que posteriormente se ha cuantificado la transferencia del haz de electrones.
Mediante el uso de bombeo diferencial, se genera un haz de electrones y se propaga libremente en el vacío de la columna superior, desde el cañón de electrones hasta PLA2, desde cuyo punto en adelante el haz de electrones pierde electrones gradualmente debido a la dispersión de electrones por las moléculas de gas. Inicialmente, la cantidad de dispersión de electrones es insignificante dentro de la cavidad intermedia, pero a medida que el haz encuentra un chorro de gas cada vez más denso formado por la PLA1, las pérdidas se vuelven significativas. [29] Después de que el haz ingresa a la cámara de muestra, las pérdidas de electrones aumentan exponencialmente a una velocidad que depende de la presión predominante, la naturaleza del gas y el voltaje de aceleración del haz. La fracción del haz transmitido a lo largo del eje PLA1 se puede ver por un conjunto de curvas características para un producto dado p 0 D, [29] donde D es el diámetro de apertura. Finalmente, el haz de electrones se dispersa y se pierde por completo, pero antes de que esto suceda, se retiene una cantidad útil de electrones en el punto enfocado original sobre una distancia finita, que aún se puede usar para la formación de imágenes. Esto es posible porque los electrones eliminados se dispersan y distribuyen sobre un área amplia como una falda ( falda de electrones ) que rodea el punto enfocado. [31] Debido a que el ancho de la falda de electrones es órdenes de magnitud mayor que el ancho del punto, con órdenes de magnitud menor de densidad de corriente, la falda contribuye solo con ruido de fondo (señal) sin participar en el contraste generado por el punto central. Las condiciones particulares de presión, distancia y voltaje del haz sobre las cuales el haz de electrones sigue siendo útil para fines de formación de imágenes se han denominado régimen de dispersión de oligo [32] en distinción de los regímenes de dispersión simple, plural y múltiple utilizados en la literatura anterior.
Para un voltaje y gas de aceleración de haz dados, la distancia L desde PLA1, sobre la cual es posible obtener imágenes útiles, es inversamente proporcional a la presión de la cámara p 0 . Como regla general, para un haz de 5 kV en el aire, se requiere que el producto p 0 L = 1 Pa·m o menos. Por este segundo principio de transferencia de haz de electrones, el diseño y el funcionamiento de un ESEM se centra en refinar y miniaturizar todos los dispositivos que controlan el movimiento y la manipulación de la muestra, y la detección de señales. El problema entonces se reduce a lograr una precisión de ingeniería suficiente para que el instrumento funcione cerca de su límite físico, correspondiente al rendimiento óptimo y al rango de capacidades. [29] [33] Se ha introducido una figura de mérito para tener en cuenta cualquier desviación de una máquina dada de la capacidad de rendimiento óptimo. [33]
El haz de electrones incide sobre la muestra y penetra hasta una profundidad determinada en función del voltaje de aceleración y de la naturaleza de la muestra. A partir de la interacción resultante, se generan señales de la misma manera que en un microscopio electrónico de barrido. De este modo, obtenemos electrones secundarios y retrodispersados, rayos X y catodoluminiscencia (luz). Todas estas señales se detectan también en el microscopio electrónico de barrido, pero con ciertas diferencias en el diseño del detector y los principios utilizados.
El detector de electrones secundarios convencional del SEM ( detector Everhart-Thornley ) no se puede utilizar en presencia de gas debido a una descarga eléctrica (arco eléctrico) causada por la polarización de kilovoltios asociada a este detector. En su lugar, se ha utilizado el propio gas ambiental como detector para la obtención de imágenes en este modo:
En una forma simple, el dispositivo de detección gaseosa (GDD) emplea un electrodo con un voltaje de hasta varios cientos de voltios para recolectar los electrones secundarios en el ESEM. El principio de este detector SE se describe mejor considerando dos placas paralelas a una distancia d entre sí con una diferencia de potencial V que genera un campo eléctrico uniforme E = V/d , y se muestra en el diagrama adjunto del GDD. [17] [27] Los electrones secundarios liberados de la muestra en el punto de impacto del haz son impulsados por la fuerza del campo hacia el electrodo del ánodo, pero los electrones también se mueven radialmente debido a la difusión térmica de las colisiones con las moléculas de gas. La variación de la fracción de recolección de electrones R dentro del radio del ánodo r vs. r/d , para valores fijos de polarización del ánodo V , en producto constante de (presión·distancia) p·d = 1 Pa·m, está dada por las curvas características adjuntas de eficiencia del GDD. Todos los electrones secundarios se detectan si los parámetros de este dispositivo están diseñados adecuadamente. Esto demuestra claramente que es posible alcanzar una eficiencia prácticamente del 100% dentro de un pequeño radio de electrodo colector con una polarización moderada. En estos niveles de polarización, no se produce ninguna descarga catastrófica. En cambio, se genera una multiplicación proporcional controlada de electrones a medida que estos chocan con moléculas de gas, liberando nuevos electrones en su camino hacia el ánodo. Este principio de amplificación de avalancha funciona de manera similar a los contadores proporcionales utilizados para detectar radiación de alta energía. La señal captada por el ánodo se amplifica y procesa para modular una pantalla de visualización y formar una imagen como en el microscopio electrónico de barrido. Cabe destacar que, en este diseño y la amplificación de electrones gaseosos asociada, el producto p·d es un parámetro independiente, de modo que existe una amplia gama de valores de presión y geometría de electrodos que se pueden describir con las mismas características. La consecuencia de este análisis es que es posible detectar los electrones secundarios en un entorno gaseoso incluso a altas presiones, dependiendo de la eficacia de ingeniería de cualquier instrumento determinado.
Otra característica del GDD es que una avalancha de centelleo gaseoso acompaña también a la avalancha de electrones y, mediante la detección de la luz producida con un fotomultiplicador, se pueden crear rutinariamente las imágenes SE correspondientes. La respuesta de frecuencia de este modo ha permitido el uso de velocidades de barrido de TV reales. [34] Este modo del detector ha sido empleado por una última generación de instrumentos comerciales.
La nueva GDD se hizo posible por primera vez en el ESEM y ha producido una eficiencia de recolección de electrones prácticamente del 100% que no era posible anteriormente con el detector de electrones secundarios Everhart-Thornley, donde las trayectorias libres de electrones en el vacío no pueden desviarse todas hacia el detector. [17] Como se explica más adelante, los electrones retrodispersados también pueden detectarse mediante las interacciones señal-gas, de modo que se deben controlar varios parámetros de este detector gaseoso generalizado para separar el componente BSE de la imagen SE. Por lo tanto, se ha tenido cuidado de producir imágenes SE casi puras con estos detectores, entonces llamados ESD (detector secundario ambiental) [35] y GSED (detector de electrones secundarios gaseosos). [36]
Los electrones retrodispersados (BSE) son aquellos que se emiten de vuelta desde la muestra debido a las interacciones entre el haz y la muestra, donde los electrones sufren dispersión elástica e inelástica . Tienen energías que van desde los 50 eV hasta la energía del haz primario según la definición convencional. Para la detección y la obtención de imágenes con estos electrones, se han utilizado en el SEM materiales centelleantes y de estado sólido. Estos materiales se han adaptado y utilizado también en ESEM, además del uso del GDD para la detección y la obtención de imágenes de BSE.
Los electrones secundarios pasan a través del volumen gaseoso entre los electrodos del GDD y generan ionización adicional y amplificación de avalancha. Hay un volumen interno donde los electrones secundarios dominan con una contribución pequeña o insignificante de los electrones secundarios, mientras que el volumen gaseoso externo es afectado principalmente por los electrones secundarios. Es posible separar los volúmenes de detección correspondientes de modo que se puedan obtener imágenes de electrones secundarios casi puros con el GDD. La relación de la fuerza relativa de las dos señales, SE y BSE, se ha calculado mediante ecuaciones detalladas de distribución de carga en el ESEM. [37] El análisis de los electrodos planos es esencial para comprender los principios y requisitos involucrados y de ninguna manera indica la mejor opción de configuración de electrodos, como se analiza en la teoría publicada del GDD.
A pesar de los avances mencionados, los detectores de BSE dedicados en el ESEM han desempeñado un papel importante, ya que el BSE sigue siendo un modo de detección muy útil que proporciona información que no es posible obtener con SE. Los medios de detección de BSE convencionales se han adaptado para funcionar en las condiciones gaseosas del ESEM. Los BSE que tienen una energía alta se autopropulsan hasta el detector correspondiente sin obstrucción significativa por las moléculas de gas. Ya se han empleado detectores de estado sólido anulares o cuadrantes para este propósito, pero su geometría no es fácilmente adaptable a los requisitos del ESEM para un funcionamiento óptimo. Como resultado, no se ha informado mucho sobre el uso de estos detectores en instrumentos ESEM genuinos a alta presión. El detector BSE "Robinson" [38] está ajustado para funcionar hasta alrededor de 100 Pa a la distancia de trabajo habitual del SEM convencional para la supresión de la carga de la muestra, mientras que la recolección de electrones a la corta distancia de trabajo y las condiciones de alta presión lo hacen inadecuado para el ESEM. Sin embargo, se han utilizado materiales de centelleo plásticos que son fácilmente adaptables para el BSE y se han fabricado a medida de acuerdo con los requisitos más estrictos del sistema. Este trabajo culminó en el uso de un par de detectores en forma de cuña que ensillan un PLA1 cónico y se apoyan en su borde, de modo que el espacio muerto de detección se reduce al mínimo, como se muestra en la figura adjunta de detectores BSE óptimos . [14] La conducción de fotones también se optimiza mediante la geometría de los conductos de luz, mientras que el par de detectores simétricos permiten la separación de la topografía (sustracción de señal) y el contraste de número atómico (adición de señal) de la superficie de la muestra para mostrarse con la mejor relación señal-ruido de la historia. Este esquema ha permitido además el uso del color superponiendo varias señales de una manera significativa. [39] Estos detectores simples pero especiales se hicieron posibles en las condiciones de ESEM, ya que el plástico desnudo no se carga por el BSE. Sin embargo, se ha propuesto una malla de alambre muy fina con el espaciado apropiado [40] como un GDD cuando hay gas presente y para conducir la carga negativa lejos de los detectores de plástico cuando se bombea el gas, hacia un ESEM universal. Además, dado que la electrónica asociada implica un fotomultiplicador con una amplia respuesta de frecuencia, se pueden obtener fácilmente velocidades de escaneo de TV reales. Este es un atributo esencial que se debe mantener con un ESEM que permite el examen de procesos in situ en tiempo real. En comparación, aún no se ha informado de una obtención de imágenes de este tipo con el modo de avalancha de electrones del GDD.
El uso de detectores de BSE centelleantes en ESEM es compatible con el GDD para la detección simultánea de SE, en un sentido, reemplazando el electrodo de plano superior con un electrodo de aguja de punta fina (detector), que se puede acomodar fácilmente con estos detectores de BSE centelleantes. El detector de aguja y la geometría cilíndrica (alambre) también se han estudiado ampliamente. [17]
La catodoluminiscencia es otro modo de detección que implica los fotones generados por la interacción entre el haz y la muestra. Se ha demostrado que este modo también funciona en ESEM mediante el uso de los tubos de luz después de que se limpiaron del revestimiento centelleante utilizado anteriormente para la detección de BSE. Sin embargo, no se sabe mucho sobre su uso fuera del prototipo experimental probado originalmente. [41] Claramente, ESEM es más potente y significativo bajo este modo de detección que SEM, ya que la superficie natural de cualquier muestra se puede examinar en el proceso de obtención de imágenes. La catodoluminiscencia es una propiedad de los materiales, pero con los diversos tratamientos necesarios para las muestras y otras limitaciones en SEM, las propiedades se oscurecen o se alteran o son imposibles de detectar y, por lo tanto, este modo de detección no se ha vuelto popular en el pasado. La llegada de ESEM con su potencial ilimitado puede provocar más interés en esta área también, en el futuro.
Los rayos X elementales característicos producidos también en el ESEM pueden detectarse con los mismos detectores utilizados en el SEM. Sin embargo, existe una complejidad adicional que surge de los rayos X producidos desde la falda de electrones. Estos rayos X provienen de un área más grande que en SEM y la resolución espacial se reduce significativamente, ya que las señales de rayos X de "fondo" no pueden simplemente "suprimirse" del volumen de interacción de la sonda. Sin embargo, se han propuesto varios esquemas para resolver este problema. [42] [43] [44] [45] Estos métodos implican el enmascaramiento de puntos, o la técnica de extrapolación variando la presión y calibrando los efectos de la falda, con lo que se ha logrado una mejora considerable.
En el SEM de vacío, el modo de corriente absorbida de la muestra se utiliza como un modo alternativo para la obtención de imágenes de muestras conductoras. La corriente de la muestra resulta de la diferencia de la corriente del haz de electrones menos la suma de la corriente SE y BSE. Sin embargo, en presencia de gas y la ionización resultante, sería problemático separar este modo de detección del dispositivo de detección gaseoso que funciona generalmente . Por lo tanto, este modo, por su definición, puede considerarse insostenible en el ESEM. Shah y Becket [8] asumieron el funcionamiento del modo de corriente absorbida de la muestra si la conductividad de su muestra estaba asegurada durante el examen de muestras botánicas húmedas; de hecho, Shah en 1987 [46] todavía consideraba los productos de ionización en gas por SE y BSE como un obstáculo formidable, ya que creía que la ionización no transportaba ninguna información sobre la muestra. Sin embargo, más tarde adoptó el papel correcto de la ionización gaseosa durante la formación de imágenes. [47]
El haz de electrones que incide sobre las muestras aislantes acumula carga negativa, lo que crea un potencial eléctrico que tiende a desviar el haz de electrones del punto escaneado en el SEM convencional. Esto aparece como artefactos de carga en la imagen, que se eliminan en el SEM depositando una capa conductora sobre la superficie de la muestra antes del examen. En lugar de este recubrimiento, el gas en el ESEM al ser eléctricamente conductor evita la acumulación de carga negativa. La buena conductividad del gas se debe a la ionización que sufre por el haz de electrones incidente y las señales ionizantes SE y BSE. [48] [49] Este principio constituye otra desviación fundamental de la microscopía electrónica de vacío convencional, con enormes ventajas.
Como consecuencia de la forma en que funciona ESEM, la resolución se conserva en relación con el SEM. Esto se debe a que el poder de resolución del instrumento está determinado por el diámetro del haz de electrones que no se ve afectado por el gas durante la distancia de recorrido útil antes de perderse por completo. [31] Esto se ha demostrado en los ESEM comerciales que proporcionan los puntos de haz más finos al obtener imágenes de muestras de prueba, es decir, habitualmente partículas de oro sobre un sustrato de carbono , tanto en vacío como en gas. Sin embargo, el contraste disminuye en consecuencia a medida que la sonda de electrones pierde corriente con la distancia de recorrido y el aumento de la presión. La pérdida de intensidad de corriente, si es necesario, se puede compensar aumentando la corriente del haz incidente que va acompañada de un mayor tamaño del punto. Por lo tanto, la resolución práctica depende del contraste de la muestra original de una característica dada, del diseño del instrumento que debería proporcionar pérdidas mínimas de haz y señal y de que el operador seleccione los parámetros correctos para cada aplicación. Los aspectos de contraste y resolución se han determinado de manera concluyente en el trabajo de referencia sobre los fundamentos de ESEM. Además, en relación con esto, tenemos que considerar los efectos de la radiación en la muestra.
La mayoría de los instrumentos disponibles ventilan su cámara de muestra a la presión ambiente (100 kPa) con cada transferencia de muestra. Se debe bombear un gran volumen de gas y reemplazarlo con el gas de interés, generalmente vapor de agua suministrado desde un depósito de agua conectado a la cámara a través de una válvula reguladora de presión (por ejemplo, de aguja). En muchas aplicaciones esto no presenta ningún problema, pero en aquellas que requieren una humedad relativa ininterrumpida del 100%, se ha descubierto que la eliminación del gas ambiental se acompaña de una reducción de la humedad relativa por debajo del nivel del 100% durante la transferencia de la muestra. [50] Esto claramente frustra el propósito mismo del ESEM para esta clase de aplicaciones. Sin embargo, tal problema no surge con el prototipo original de ESEM que utiliza una cámara de transferencia de muestra intermedia, de modo que la cámara principal siempre se mantiene a una humedad relativa del 100% sin interrupciones durante un estudio. [51] La cámara de transferencia de muestras (tr-ch) que se muestra en el diagrama de las etapas de presión de gas de ESEM contiene un pequeño depósito de agua para que el aire ambiente inicial pueda bombearse rápidamente y reemplazarse prácticamente instantáneamente con vapor de agua sin pasar por un tubo de conductancia limitado y una válvula. La cámara de muestras principal se puede mantener a una humedad relativa del 100%, si la única fuga de vapor es a través del pequeño PLA1, pero no durante el bombeo violento con cada cambio de muestra. Una vez que la muestra húmeda está en equilibrio con una humedad relativa del 100% en la cámara de transferencia, en cuestión de segundos, se abre una válvula de compuerta y la muestra se transfiere a la cámara de muestras principal mantenida a la misma presión. Un enfoque alternativo que implique el bombeo controlado de la cámara principal [50] puede no resolver el problema por completo, ya sea porque no se puede alcanzar la humedad relativa del 100% de manera monótona sin ningún secado, o porque el proceso es muy lento; la inclusión de un depósito de agua dentro de la cámara principal significa que no se puede reducir la humedad relativa hasta que se haya bombeado toda el agua (es decir, un control defectuoso de la humedad relativa).
Durante la interacción de un haz de electrones con una muestra, los cambios en la muestra en diversos grados son casi inevitables. Estos cambios, o efectos de la radiación, pueden o no ser visibles tanto en SEM como en ESEM. Sin embargo, estos efectos son particularmente importantes en ESEM, ya que se afirma que es posible ver las muestras en su estado natural. La eliminación del vacío es un gran éxito en la consecución de este objetivo, por lo que cualquier efecto perjudicial del propio haz de electrones requiere una atención especial. La mejor manera de solucionar este problema es reducir estos efectos al mínimo absoluto con un diseño ESEM óptimo. Más allá de esto, el usuario debe ser consciente de su posible existencia durante la evaluación de los resultados. Por lo general, estos efectos aparecen en las imágenes en diversas formas debido a diferentes interacciones y procesos entre el haz de electrones y la muestra. [52]
La introducción de gas en un microscopio electrónico supone una nueva dimensión. Así, las interacciones entre el haz de electrones y el gas, junto con las interacciones del gas (y sus subproductos) con la muestra, abren un nuevo campo de investigación con consecuencias aún desconocidas. Algunas de ellas pueden parecer desventajosas al principio, pero luego se superan; otras pueden dar resultados inesperados. La fase líquida en la muestra con radicales móviles puede dar lugar a una serie de fenómenos, que pueden ser ventajosos o desventajosos.
La presencia de gas alrededor de una muestra crea nuevas posibilidades exclusivas de ESEM: (a) la microscopía electrónica en fase líquida [53] es posible ya que cualquier presión mayor a 609 Pa permite que el agua se mantenga en su fase líquida para temperaturas superiores a 0 °C, en contraste con el SEM donde las muestras se desecan por la condición de vacío. (b) Las muestras eléctricamente no conductoras no requieren las técnicas de preparación utilizadas en SEM para hacer que la superficie sea conductora, como la deposición de una fina capa de oro o carbono, u otros tratamientos, técnicas que también requieren vacío en el proceso. Las muestras aislantes se cargan por el haz de electrones, lo que hace que la obtención de imágenes sea problemática o incluso imposible. (c) El gas en sí se utiliza como medio de detección produciendo nuevas posibilidades de obtención de imágenes, a diferencia de los detectores SEM de vacío. (d) Los detectores BSE centelleantes de plástico simple pueden funcionar sin recubrimiento sin carga. Por lo tanto, estos detectores producen la mayor relación señal-ruido posible con el menor voltaje de aceleración posible, porque los BSE no disipan ninguna energía en un recubrimiento de aluminio utilizado para el SEM de vacío.
Como resultado, las muestras se pueden examinar más rápido y más fácilmente, evitando métodos de preparación complejos y que consumen mucho tiempo, sin modificar la superficie natural ni crear artefactos por el trabajo de preparación anterior o el vacío del SEM. Las interacciones gas/líquido/sólido se pueden estudiar dinámicamente in situ y en tiempo real, o registrarse para el posprocesamiento. Las variaciones de temperatura desde bajo cero hasta más de 1000 °C y varios dispositivos auxiliares para la micromanipulación de muestras se han convertido en una nueva realidad. Las muestras biológicas se pueden mantener frescas y vivas. Por lo tanto, ESEM constituye un avance radical con respecto a la microscopía electrónica convencional, donde la condición de vacío impedía que las ventajas de la obtención de imágenes por haz de electrones se volvieran universales.
La principal desventaja surge de la limitación de la distancia en la cámara de la muestra sobre la cual el haz de electrones permanece utilizable en el entorno gaseoso. La distancia útil de la muestra desde el PLA1 es una función del voltaje de aceleración, la corriente del haz, la naturaleza y presión del gas, y del diámetro de apertura utilizado. [29] [33] Esta distancia varía de alrededor de 10 mm a una fracción de milímetro ya que la presión del gas puede variar desde un vacío bajo hasta una atmósfera. Para un funcionamiento óptimo, tanto el fabricante como el usuario deben ajustarse, en el diseño y el funcionamiento, para satisfacer este requisito fundamental. Además, como la presión se puede llevar a un nivel muy bajo, un ESEM volverá al funcionamiento típico de un SEM sin las desventajas anteriores. Por lo tanto, se pueden equilibrar las características del ESEM con las del SEM operando en vacío. Se puede lograr una conciliación de todas estas desventajas y ventajas mediante un ESEM universal diseñado y operado adecuadamente.
Junto con la limitación de la distancia útil de la muestra está el aumento mínimo posible, ya que a presiones muy altas la distancia se vuelve tan pequeña que el campo de visión está limitado por el tamaño de PLA1. En el rango de aumento muy bajo del SEM, que se superpone al aumento superior de un microscopio óptico, el campo superior está limitado en un grado variable por el modo ESEM. El grado de esta limitación depende en gran medida del diseño del instrumento.
Como los rayos X también son generados por el gas circundante y además provienen de un área de muestra más grande que en el SEM, se requieren algoritmos especiales para deducir los efectos del gas en la información extraída durante el análisis.
La presencia de gas puede producir efectos no deseados en ciertas aplicaciones, pero su alcance solo se aclarará a medida que se realicen más investigaciones y desarrollos para minimizar y controlar los efectos de la radiación.
Todavía no se dispone (hasta 2009) de ningún instrumento comercial que cumpla todos los principios de un diseño óptimo, por lo que cualquier otra limitación enumerada es característica de los instrumentos existentes y no de la técnica ESEM en general.
El ESEM también se puede utilizar en modo de transmisión (TESEM) mediante medios de detección adecuados de las señales de campo claro y oscuro transmitidas a través de una sección delgada de la muestra. Esto se hace empleando detectores de estado sólido debajo de la muestra, [54] o el uso del dispositivo de detección gaseosa (GDD). [55] Los voltajes de aceleración generalmente bajos utilizados en ESEM mejoran el contraste de las muestras no teñidas mientras que permiten imágenes con resolución nanométrica como las obtenidas en modo de transmisión, especialmente con el tipo de emisión de campo de los cañones de electrones.
ESEM-DIA es una abreviatura que designa un sistema que consiste en un microscopio ESEM acoplado a un programa de análisis de imágenes digitales (DIA). Permite directamente el tratamiento cuantitativo de las imágenes ESEM adquiridas digitalmente, y permite el reconocimiento y procesamiento de imágenes mediante aprendizaje automático basado en redes neuronales. [56] [57] [58]
Algunas aplicaciones representativas de ESEM se encuentran en las siguientes áreas:
Una de las primeras aplicaciones fue el examen de material vegetal fresco y vivo, incluido un estudio de Leptospermum flavescens . [59] Se han demostrado las ventajas de ESEM en los estudios de microorganismos [35] y una comparación de técnicas de preparación. [60]
Se ha estudiado la influencia de los fármacos sobre las células cancerosas mediante ESEM-STEM en fase líquida. [61]
En la ciencia de la conservación, a menudo es necesario preservar los especímenes intactos o en su estado natural. [62]
Se han realizado estudios ESEM en fibras en la industria de la lana con y sin tratamientos químicos y mecánicos particulares. [63] En la industria del cemento, es importante examinar varios procesos in situ en estado húmedo y seco. [64] [65]
Los estudios in situ se pueden realizar con la ayuda de diversos dispositivos auxiliares, entre los que se incluyen plataformas calientes para observar procesos a temperaturas elevadas, [66] microinyectores de líquidos [67] y dispositivos de extensión o deformación de muestras. [68]
Las biopelículas se pueden estudiar sin los artefactos introducidos durante la preparación del SEM, [69] [70] así como también la dentina [71] y los detergentes [72] se han investigado desde los primeros años del ESEM.
El ESEM ha aparecido bajo diferentes nombres comerciales de fabricación. El término ESEM es un nombre genérico introducido públicamente por primera vez en 1980 [73] [74] y luego utilizado incesantemente en todas las publicaciones por Danilatos y casi todos los usuarios de todos los instrumentos de tipo ESEM. La marca registrada ELECTROSCAN ESEM se obtuvo de manera intermitente hasta 1999, cuando se le permitió caducar. La palabra "ambiental" se introdujo originalmente como continuación del uso previo (histórico) de celdas "ambientales" en microscopía de transmisión, aunque la palabra "atmosférica" también se ha utilizado para referirse a un ESEM a una presión atmosférica (ASEM) [14] pero no con ningún instrumento comercial. Otros fabricantes de la competencia han utilizado los términos "SEM natural" [75] (Hitachi), "SEM húmedo" [76] (ISI), "Bio-SEM" (de corta duración, AMRAY), "VP-SEM" [77] (SEM de presión variable; LEO/Zeiss-SMT), "LVSEM" [78] (SEM de bajo vacío, que a menudo también denota SEM de bajo voltaje; [79] JEOL), todos los cuales parecen ser transitorios en el tiempo según los programas de fabricación vigentes. Hasta hace poco, todos estos nombres se referían a instrumentos que operaban hasta aproximadamente 100 Pa y solo con detectores BSE. Últimamente, el VP-SEM de Zeiss-SMT se ha extendido a presiones más altas junto con una ionización gaseosa o centelleo gaseoso como mecanismo de SE para la formación de imágenes. Por lo tanto, es inadecuado identificar el término ESEM con una única marca de instrumento comercial en yuxtaposición a otras marcas comerciales (o de laboratorio) competidoras con nombres diferentes, ya que puede surgir cierta confusión a partir del uso anterior de marcas comerciales.
De manera similar, el término GDD es genérico y abarca todo el nuevo principio de detección de gases en ESEM. Los términos ESD y GSED, en particular, se han utilizado en conjunción con un ESEM comercial para indicar el modo de electrones secundarios de este detector.
Los siguientes son ejemplos de imágenes tomadas con un ESEM.
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