Luciferasa es un término genérico para la clase de enzimas oxidativas que producen bioluminiscencia y generalmente se distingue de una fotoproteína . El nombre fue utilizado por primera vez por Raphaël Dubois , quien inventó las palabras luciferina y luciferasa , para el sustrato y la enzima , respectivamente. [1] Ambas palabras se derivan de la palabra latina lucifer , que significa "portador de luz", que a su vez se deriva de las palabras latinas para "luz" ( lux) y "traer o llevar" ( ferre) . [2]
Las luciferasas se utilizan ampliamente en biotecnología , para microscopía de imágenes de bioluminiscencia [3] y como genes indicadores , para muchas de las mismas aplicaciones que las proteínas fluorescentes . Sin embargo, a diferencia de las proteínas fluorescentes, las luciferasas no requieren una fuente de luz externa , pero sí la adición de luciferina , el sustrato consumible.
Una variedad de organismos regulan su producción de luz utilizando diferentes luciferasas en una variedad de reacciones de emisión de luz. La mayoría de las luciferasas estudiadas se han encontrado en animales, incluidas luciérnagas , [4] y muchos animales marinos como copépodos , medusas y pensamientos marinos . Sin embargo, las luciferasas se han estudiado en hongos luminosos, como el hongo Jack-O-Lantern , así como ejemplos en otros reinos, incluidas las bacterias bioluminiscentes y los dinoflagelados .
Las luciferasas de las luciérnagas , de las que existen más de 2.000 especies , y de otros Elateroidea (escarabajos clic y parientes en general) son lo suficientemente diversas como para ser útiles en la filogenia molecular . [5] En las luciérnagas, el oxígeno necesario se suministra a través de un tubo en el abdomen llamado tráquea abdominal . Una luciferasa bien estudiada es la de la luciérnaga Photinini Photinus pyralis , que tiene un pH óptimo de 7,8. [6]
También está bien estudiado el pensamiento de mar , Renilla reniformis . En este organismo, la luciferasa ( Renilla-luciferina 2-monooxigenasa ) está estrechamente asociada con una proteína de unión a luciferina, así como con una proteína verde fluorescente ( GFP ). El calcio desencadena la liberación de luciferina ( coelenterazina ) de la proteína fijadora de luciferina. Luego, el sustrato está disponible para la oxidación por la luciferasa, donde se degrada a coelenteramida con la consiguiente liberación de energía. En ausencia de GFP, esta energía se liberaría como un fotón de luz azul (longitud de onda máxima de emisión de 482 nm). Sin embargo, debido a la GFP estrechamente asociada, la energía liberada por la luciferasa se acopla mediante transferencia de energía de resonancia al fluoróforo de la GFP y posteriormente se libera como un fotón de luz verde (longitud de onda de emisión máxima de 510 nm). La reacción catalizada es: [7]
Recientemente se han identificado luciferasas más nuevas que, a diferencia de otras luciferasas, son moléculas secretadas de forma natural. Un ejemplo de ello es la luciferasa dependiente de coelenterazina de Metridia (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) que se deriva del copépodo marino Metridia longa . El gen de la luciferasa secretada por Metridia longa codifica una proteína de 24 kDa que contiene un péptido señal secretor N-terminal de 17 residuos de aminoácidos . La sensibilidad y la alta intensidad de la señal de esta molécula de luciferasa resultan ventajosas en muchos estudios informativos. Algunos de los beneficios de utilizar una molécula informadora secretada como MetLuc es su protocolo sin lisis que permite realizar ensayos con células vivas y múltiples ensayos en la misma célula. [8]
La bioluminiscencia bacteriana se observa en especies de Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi y Vibrio harveyi . La emisión de luz en algunas bacterias bioluminiscentes utiliza una 'antena' como la proteína lumazina para aceptar la energía del estado excitado primario de la luciferasa, lo que da como resultado un cromóforo de lulnazina excitado que emite luz de una longitud de onda más corta (más azul), mientras que en otras utiliza una proteína fluorescente amarilla (YFP) con mononucleótido de flavina (FMN) como cromóforo y emite luz que está desplazada al rojo en relación con la de la luciferasa. [9]
La luciferasa dinoflagelada es una proteína eucariota multidominio , que consta de un dominio N-terminal y tres dominios catalíticos , cada uno de los cuales precedido por un dominio de haz helicoidal. Se ha resuelto la estructura del dominio catalítico de la luciferasa de dinoflagelados. [10] La parte central del dominio es un barril beta de 10 cadenas que es estructuralmente similar a las lipocalinas y FABP . [10] El dominio N-terminal se conserva entre la luciferasa de dinoflagelado y las proteínas de unión a luciferina (LBP). Se ha sugerido que esta región puede mediar en una interacción entre LBP y luciferasa o su asociación con la membrana vacuolar . [11] El dominio del haz helicoidal tiene una estructura de haz de tres hélices que contiene cuatro histidinas importantes que se cree que desempeñan un papel en la regulación del pH de la enzima . [10] Hay una gran bolsa en el barril β de la luciferasa dinoflagelada a pH 8 para acomodar el sustrato de tetrapirrol , pero no hay ninguna abertura que permita la entrada del sustrato. Por lo tanto, debe ocurrir un cambio conformacional significativo para proporcionar acceso y espacio para un ligando en el sitio activo y la fuente de este cambio es a través de los cuatro residuos de histidina N-terminales. [10] A pH 8, se puede observar que los residuos de histidina no protonados están involucrados en una red de enlaces de hidrógeno en la interfaz de las hélices en el haz que bloquean el acceso del sustrato al sitio activo y la interrupción de esta interacción por protonación (a pH 6,3) o mediante la sustitución de los residuos de histidina por alanina provoca un gran movimiento molecular del haz, separando las hélices en 11 Å y abriendo el sitio catalítico. [10] Lógicamente, los residuos de histidina no pueden ser reemplazados por alanina en la naturaleza, pero este reemplazo experimental confirma además que los residuos de histidina más grandes bloquean el sitio activo. Además, tres secuencias Gly-Gly, una en la hélice N-terminal y dos en el motivo hélice-bucle-hélice, podrían servir como bisagras alrededor de las cuales giran las cadenas para abrir aún más el camino hacia el sitio catalítico y ampliar el sitio activo. sitio. [10]
Una luciferasa de dinoflagelado es capaz de emitir luz debido a su interacción con su sustrato ( luciferina ) y la proteína de unión a luciferina (LBP) en el orgánulo de centelleo que se encuentra en los dinoflagelados. [10] La luciferasa actúa de acuerdo con la luciferina y la LBP para emitir luz, pero cada componente funciona a un pH diferente. La luciferasa y sus dominios no son activos a pH 8, pero son extremadamente activos al pH óptimo de 6,3, mientras que LBP se une a la luciferina a pH 8 y la libera a pH 6,3. [10] En consecuencia, la luciferina sólo se libera para reaccionar con una luciferasa activa cuando el centelleo se acidifica a pH 6,3. Por lo tanto, para reducir el pH, se abren canales dependientes de voltaje en la membrana de centelleo para permitir la entrada de protones de una vacuola que posee un potencial de acción producido a partir de una estimulación mecánica. [10] Por lo tanto, se puede ver que el potencial de acción en la membrana vacuolar conduce a la acidificación y esto a su vez permite que la luciferina se libere para reaccionar con la luciferasa en el centelleo, produciendo un destello de luz azul.
Todas las luciferasas se clasifican como oxidorreductasas ( EC 1.13.12.-), lo que significa que actúan sobre donantes individuales con incorporación de oxígeno molecular. Debido a que las luciferasas pertenecen a muchas familias de proteínas diversas que no están relacionadas, no existe un mecanismo unificador, ya que cualquier mecanismo depende de la combinación de luciferasa y luciferina. Sin embargo, se ha demostrado que todas las reacciones luciferasa-luciferina caracterizadas hasta la fecha requieren oxígeno molecular en algún momento.
La reacción catalizada por la luciferasa bacteriana también es un proceso oxidativo:
En la reacción, el oxígeno molecular oxida el mononucleótido de flavina y un aldehído alifático de cadena larga a un ácido carboxílico alifático . La reacción forma un intermedio de hidroxiflavina excitado, que se deshidrata hasta formar el producto FMN para emitir luz azul-verde. [12]
Casi toda la energía aportada a la reacción se transforma en luz. La reacción tiene una eficacia del 80 % [13] al 90 % [14] . En comparación, una bombilla incandescente sólo convierte alrededor del 10% de su energía en luz [15] y un LED de 150 lúmenes por vatio (lm/W) convierte el 20% de la energía de entrada en luz visible. [14]
Las luciferasas se pueden producir en el laboratorio mediante ingeniería genética para diversos fines. Los genes de luciferasa pueden sintetizarse e insertarse en organismos o transfectarse en células. En 2002, ratones , gusanos de seda y patatas son sólo algunos de los organismos que ya han sido modificados para producir la proteína. [dieciséis]
En la reacción de la luciferasa, se emite luz cuando la luciferasa actúa sobre el sustrato de luciferina apropiado . La emisión de fotones puede detectarse mediante aparatos sensibles a la luz, como un luminómetro o un microscopio óptico con una cámara CCD . Esto permite la observación de procesos biológicos. [17] Dado que la excitación de la luz no es necesaria para la bioluminiscencia de la luciferasa, hay una autofluorescencia mínima y, por lo tanto, la señal bioluminiscente está prácticamente libre de fondo. [18] Por lo tanto, todavía se puede medir con precisión tan solo 0,02 pg utilizando un contador de centelleo estándar . [19]
En la investigación biológica, la luciferasa se utiliza comúnmente como indicador para evaluar la actividad transcripcional en células que se transfectan con una construcción genética que contiene el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor de interés. [20] Además, las moléculas proluminiscentes que se convierten en luciferina tras la actividad de una enzima particular se pueden usar para detectar la actividad enzimática en ensayos de luciferasa acoplados o de dos pasos. Dichos sustratos se han utilizado para detectar la actividad de caspasa y la actividad del citocromo P450 , entre otras. [17] [20]
La luciferasa también se puede utilizar para detectar el nivel de ATP celular en ensayos de viabilidad celular o para ensayos de actividad quinasa. [20] [21] La luciferasa puede actuar como una proteína sensora de ATP mediante biotinilación . La biotinilación inmovilizará la luciferasa en la superficie celular uniéndose a un complejo de estreptavidina - biotina . Esto permite que la luciferasa detecte la salida de ATP de la célula y mostrará efectivamente la liberación de ATP en tiempo real a través de bioluminiscencia. [22] Además, la luciferasa puede hacerse más sensible para la detección de ATP aumentando la intensidad de la luminiscencia cambiando ciertos residuos de aminoácidos en la secuencia de la proteína. [23]
Las imágenes de todo el organismo (denominadas in vivo cuando están intactas o, también llamadas imágenes ex vivo, por ejemplo de tejido vivo pero explantado) son una técnica poderosa para estudiar poblaciones de células en plantas o animales vivos, como los ratones. [24] Se pueden diseñar diferentes tipos de células (por ejemplo, células madre de la médula ósea, células T) para que expresen una luciferasa, lo que permite su visualización no invasiva dentro de un animal vivo utilizando una cámara sensible con un dispositivo de par de carga ( cámara CCD ). se ha utilizado para seguir la tumorigénesis y la respuesta de los tumores al tratamiento en modelos animales. [25] [26] Sin embargo, los factores ambientales y las interferencias terapéuticas pueden causar algunas discrepancias entre la carga tumoral y la intensidad de la bioluminiscencia en relación con los cambios en la actividad proliferativa. La intensidad de la señal medida mediante imágenes in vivo puede depender de varios factores, como la absorción de D -luciferina a través del peritoneo, el flujo sanguíneo, la permeabilidad de la membrana celular, la disponibilidad de cofactores, el pH intracelular y la transparencia del tejido suprayacente, además de la cantidad de luciferasa. [27]
La luciferasa es una proteína termosensible que se utiliza en estudios sobre desnaturalización de proteínas , probando las capacidades protectoras de las proteínas de choque térmico . Las oportunidades para utilizar la luciferasa continúan ampliándose. [28]
En noviembre de 2021, Emerald Robinson , corresponsal en la Casa Blanca del medio conservador Newsmax , tuiteó una declaración falsa de que una vacuna COVID-19 contenía luciferasa que se usaba para rastrear personas. [29] [30] Newsmax eliminó a Robinson del aire y declaró: "No hemos visto ninguna evidencia que sugiera que LUCIFERASE o LUCIFERIN estén presentes en alguna vacuna o que se utilicen como algún tipo de marcador bioluminiscente". [31]
Medios relacionados con la luciferasa en Wikimedia Commons