La inmunoprecipitación ( IP ) es la técnica de precipitar un antígeno proteico de una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína particular a partir de una muestra que contiene miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento del procedimiento.
Implica el uso de un anticuerpo que es específico de una proteína conocida para aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones a menudo estarán en forma de un lisado crudo de un tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras podrían ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.
La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, el antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como coinmunoprecipitación (Co-IP). Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo más grande de proteínas. Al apuntar a este miembro conocido con un anticuerpo, puede ser posible sacar todo el complejo proteico de la solución y así identificar miembros desconocidos del complejo.
Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen estrechamente entre sí, lo que hace posible extraer múltiples miembros del complejo de la solución al unir un miembro con un anticuerpo. Este concepto de sacar complejos de proteínas de la solución a veces se denomina "desplegamiento". Co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína .
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma para una proteína de interés particular. Esta técnica ofrece una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células o tejidos vivos. La naturaleza in vivo de este método contrasta con otros enfoques empleados tradicionalmente para responder a las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas ) en las células vivas pueden entrecruzarse con el ADN al que se unen. Al utilizar un anticuerpo que es específico de una supuesta proteína de unión al ADN, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de lisados celulares. La reticulación a menudo se logra aplicando formaldehído a las células (o al tejido), aunque a veces es ventajoso utilizar un reticulante más definido y consistente como el dimetil 3,3′-ditiobispropionimidato-2 HCl (DTBP). [1] Después de la reticulación, las células se lisan y el ADN se rompe en pedazos de 0,2 a 1,0 kb de longitud mediante sonicación . En este punto se realiza la inmunoprecipitación que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Luego, los complejos de proteína y ADN purificados se calientan para revertir el entrecruzamiento con formaldehído de los complejos de proteína y ADN, permitiendo que el ADN se separe de las proteínas. A continuación se puede determinar la identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar la PCR en los fragmentos aislados es que se debe tener una idea de a qué región genómica se dirige para generar los cebadores de PCR correctos. A veces, esta limitación se evita simplemente clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico y luego usando cebadores que sean específicos de la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando se quiere encontrar dónde se une la proteína a escala de todo el genoma, se utiliza la secuenciación ChIP , que recientemente ha surgido como una tecnología estándar que puede localizar los sitios de unión de proteínas de una manera rentable y de alto rendimiento, permitiendo también para la caracterización del cistrome . Anteriormente, también se utilizaban microarrays de ADN ( ChIP-on-chip o ChIP-chip ).
Tanto RIP como CLIP purifican una proteína de unión a ARN específica para identificar los ARN unidos, estudiando así las ribonucleoproteínas (RNP). [2] [3] En RIP , los ARN copurificados se extraen y su enriquecimiento se compara con el control, que originalmente se realizó mediante microarrays o RT-PCR . En CLIP , las células se reticulan con luz ultravioleta antes de la lisis, seguidas de pasos de purificación adicionales más allá de la inmunoprecipitación estándar, incluida la fragmentación parcial del ARN, el lavado con alto contenido de sal, la separación por SDS-PAGE y la transferencia de membrana, y la identificación de sitios de unión directa al ARN mediante secuenciación del ADNc .
Uno de los principales obstáculos técnicos de la inmunoprecipitación es la gran dificultad para generar un anticuerpo que se dirija específicamente a una única proteína conocida. Para sortear este obstáculo, muchos grupos diseñarán etiquetas en el extremo C o N-terminal de la proteína de interés. La ventaja aquí es que la misma etiqueta se puede usar una y otra vez en muchas proteínas diferentes y el investigador puede usar el mismo anticuerpo cada vez. Las ventajas del uso de proteínas marcadas son tan grandes que esta técnica se ha convertido en algo común para todos los tipos de inmunoprecipitación, incluidos todos los tipos de IP detallados anteriormente. Ejemplos de etiquetas en uso son la etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), la etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST) y la etiqueta FLAG . Si bien el uso de una etiqueta para habilitar menús desplegables es conveniente, genera algunas preocupaciones con respecto a la relevancia biológica porque la etiqueta en sí puede ocultar las interacciones nativas o introducir interacciones nuevas y antinaturales.
Los dos métodos generales de inmunoprecipitación son el método de captura directa y el método de captura indirecta.
Los anticuerpos que son específicos para una proteína (o grupo de proteínas) en particular se inmovilizan en un sustrato en fase sólida, como microperlas superparamagnéticas o en perlas microscópicas de agarosa (no magnéticas). Luego, las perlas con anticuerpos unidos se agregan a la mezcla de proteínas y las proteínas a las que se dirigen los anticuerpos se capturan en las perlas a través de los anticuerpos; en otras palabras, se inmunoprecipitan.
Los anticuerpos que son específicos de una proteína particular o de un grupo de proteínas se añaden directamente a la mezcla de proteínas. Los anticuerpos aún no se han unido a un soporte de fase sólida. Los anticuerpos pueden flotar libremente alrededor de la mezcla de proteínas y unirse a sus objetivos. A medida que pasa el tiempo, se añaden perlas recubiertas de proteína A/G a la mezcla de anticuerpo y proteína. En este punto, los anticuerpos, que ahora están unidos a sus objetivos, se adherirán a las perlas.
A partir de este momento, los protocolos directo e indirecto convergen porque las muestras ahora tienen los mismos ingredientes. Ambos métodos dan el mismo resultado final con la proteína o los complejos de proteínas unidos a los anticuerpos que a su vez están inmovilizados en las perlas.
A veces se prefiere un enfoque indirecto cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica del anticuerpo por la proteína es débil. El método indirecto también se utiliza cuando la cinética de unión del anticuerpo a la proteína es lenta por diversas razones. En la mayoría de las situaciones, el método directo es la opción predeterminada y preferida.
Históricamente, el soporte en fase sólida para la inmunoprecipitación utilizado por la mayoría de los científicos han sido perlas de agarosa altamente porosas (también conocidas como resinas o suspensiones de agarosa). La ventaja de esta tecnología es una capacidad de unión potencial muy alta, ya que prácticamente toda la estructura esponjosa de la partícula de agarosa (de 50 a 150 μm de tamaño) está disponible para unir anticuerpos (que a su vez se unirán a las proteínas diana) y la uso de equipos de laboratorio estándar para todos los aspectos del protocolo IP sin necesidad de ningún equipo especializado. La ventaja de una capacidad de unión extremadamente alta debe equilibrarse cuidadosamente con la cantidad de anticuerpo que el investigador está dispuesto a utilizar para recubrir las perlas de agarosa. Debido a que los anticuerpos pueden ser un factor limitante de costos, es mejor calcular hacia atrás desde la cantidad de proteína que se debe capturar (dependiendo del análisis que se realizará posteriormente) hasta la cantidad de anticuerpo que se requiere para unirse a esa cantidad de proteína. proteína (con un pequeño exceso agregado para compensar las ineficiencias del sistema), y retrocediendo aún más hasta la cantidad de agarosa que se necesita para unir esa cantidad particular de anticuerpo. En los casos en los que no se requiere la saturación de anticuerpos, esta tecnología no tiene comparación en su capacidad para capturar cantidades extremadamente grandes de proteínas objetivo capturadas. La advertencia aquí es que la "ventaja de alta capacidad" puede convertirse en una "desventaja de alta capacidad" que se manifiesta cuando la enorme capacidad de unión de las perlas de sefarosa /agarosa no está completamente saturada con anticuerpos. A menudo sucede que la cantidad de anticuerpo disponible para el investigador para su experimento de inmunoprecipitación es menos que suficiente para saturar las perlas de agarosa que se utilizarán en la inmunoprecipitación. En estos casos, el investigador puede terminar con partículas de agarosa que sólo están parcialmente recubiertas con anticuerpos, y la porción de la capacidad de unión de las perlas de agarosa que no está recubierta con anticuerpo queda libre para unirse a cualquier cosa que se adhiera, lo que resulta en un nivel elevado. señal de fondo debido a la unión no específica de los componentes del lisado a las perlas, lo que puede dificultar la interpretación de los datos. Si bien algunos pueden argumentar que por estas razones es prudente hacer coincidir la cantidad de agarosa (en términos de capacidad de unión) con la cantidad de anticuerpo que se desea unir para la inmunoprecipitación, una forma sencilla de reducir el problema de las reacciones no específicas La unión a perlas de agarosa y el aumento de la especificidad consisten en aclarar previamente el lisado, lo que es muy recomendable para cualquier inmunoprecipitación. [4] [5]
Los lisados son mezclas complejas de proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, y se debe suponer que se producirá cierta cantidad de unión no específica al anticuerpo IP, la proteína A/G o el soporte de perlas y afectará negativamente la detección del objetivo inmunoprecipitado. (s). En la mayoría de los casos, la limpieza previa del lisado al inicio de cada experimento de inmunoprecipitación (consulte el paso 2 en la sección "protocolo" a continuación) [6] es una forma de eliminar componentes potencialmente reactivos del lisado celular antes de la inmunoprecipitación para evitar la no- unión específica de estos componentes a las perlas IP o al anticuerpo. El procedimiento básico de preaclaración se describe a continuación, en el que el lisado se incuba solo con perlas, que luego se retiran y desechan antes de la inmunoprecipitación. [6] Sin embargo, este enfoque no tiene en cuenta la unión no específica al anticuerpo IP, que puede ser considerable. Por lo tanto, un método alternativo de preaclaración es incubar la mezcla de proteínas con exactamente los mismos componentes que se usarán en la inmunoprecipitación, excepto que se usa un anticuerpo irrelevante y no objetivo de la misma subclase de anticuerpos que el anticuerpo IP en lugar del IP. anticuerpo mismo. [5] Este enfoque intenta utilizar condiciones y componentes IP tan cercanos como la inmunoprecipitación real para eliminar cualquier componente celular no específico sin capturar la proteína objetivo (a menos, por supuesto, que la proteína objetivo se una de forma no específica a alguna otra proteína). componente IP, que debe controlarse adecuadamente mediante el análisis de las perlas desechadas utilizadas para aclarar previamente el lisado). Luego, la proteína objetivo se puede inmunoprecipitar con el riesgo reducido de que una unión no específica interfiera con la interpretación de los datos.
Si bien la gran mayoría de las inmunoprecipitaciones se realizan con perlas de agarosa, el uso de perlas superparamagnéticas para la inmunoprecipitación es un enfoque más nuevo que está ganando popularidad como alternativa a las perlas de agarosa para aplicaciones IP. A diferencia de la agarosa, las perlas magnéticas son sólidas y pueden ser esféricas, según el tipo de perla, y la unión del anticuerpo se limita a la superficie de cada perla. Si bien estas perlas no tienen la ventaja de un centro poroso para aumentar la capacidad de unión, las perlas magnéticas son significativamente más pequeñas que las perlas de agarosa (1 a 4 μm), y el mayor número de perlas magnéticas por volumen que las perlas de agarosa en conjunto les da a las perlas magnéticas una relación superficie-volumen eficaz para una unión óptima del anticuerpo.
Las perlas magnéticas disponibles comercialmente se pueden separar según la uniformidad del tamaño en perlas monodispersas y polidispersas . Las perlas monodispersas, también llamadas microperlas , exhiben una uniformidad exacta y, por lo tanto, todas las perlas exhiben características físicas idénticas, incluida la capacidad de unión y el nivel de atracción a los imanes. Las perlas polidispersas, aunque tienen un tamaño similar a las monodispersas, muestran una amplia gama de variabilidad de tamaño (1 a 4 μm) que puede influir en su capacidad de unión y captura magnética. Aunque ambos tipos de perlas están disponibles comercialmente para aplicaciones de inmunoprecipitación, las perlas superparamagnéticas monodispersas de mayor calidad son más ideales para protocolos automáticos debido a su tamaño, forma y rendimiento consistentes. Muchas empresas, incluidas Invitrogen , Thermo Scientific y Millipore , ofrecen perlas superparamagnéticas monodispersas y polidispersas .
Los defensores de las perlas magnéticas afirman que las perlas exhiben una velocidad de unión a proteínas más rápida [7] [8] [9] que las perlas de agarosa para aplicaciones de inmunoprecipitación, aunque las inmunoprecipitaciones estándar basadas en perlas de agarosa se han realizado en 1 hora. [5] También se ha afirmado que las perlas magnéticas son mejores para inmunoprecipitar complejos proteicos extremadamente grandes debido a la falta total de un límite de tamaño superior para tales complejos, [7] [8] [10] aunque no hay evidencia imparcial que lo confirme. afirmar. La naturaleza de la tecnología de perlas magnéticas da como resultado una menor manipulación de muestras [8] debido a la reducción del estrés físico en las muestras de la separación magnética versus la centrifugación repetida cuando se usa agarosa, lo que puede contribuir en gran medida a aumentar el rendimiento de complejos proteicos lábiles (frágiles). [8] [9] [10] Sin embargo, en la selección de un soporte de inmunoprecipitación se deben considerar factores adicionales, como la capacidad de unión, el costo del reactivo, el requisito de equipo adicional y la capacidad de automatizar procesos IP.
Los defensores de las perlas magnéticas y de agarosa pueden argumentar si la gran diferencia en las capacidades de unión de las dos perlas favorece a un tipo particular de perlas. En una comparación entre perlas, las perlas de agarosa tienen una superficie significativamente mayor y, por lo tanto, una mayor capacidad de unión que las perlas magnéticas debido al gran tamaño de las perlas y a su estructura similar a una esponja. Pero el tamaño de poro variable de la agarosa provoca un límite de tamaño superior potencial que puede afectar la unión de proteínas o complejos de proteínas extremadamente grandes a los sitios de unión internos y, por lo tanto, las perlas magnéticas pueden ser más adecuadas para inmunoprecipitar proteínas o complejos de proteínas grandes que las perlas de agarosa. aunque falta evidencia comparativa independiente que pruebe cualquiera de los dos casos.
Algunos argumentan que la capacidad de unión significativamente mayor de las perlas de agarosa puede ser una desventaja debido a la mayor capacidad de unión no específica. Otros pueden argumentar a favor del uso de perlas magnéticas debido a la mayor cantidad de anticuerpo requerida para saturar la capacidad de unión total de las perlas de agarosa, lo que obviamente sería una desventaja económica del uso de agarosa. Si bien estos argumentos son correctos fuera del contexto de su uso práctico, estas líneas de razonamiento ignoran dos aspectos clave del principio de inmunoprecipitación que demuestra que la decisión de utilizar agarosa o perlas magnéticas no está determinada simplemente por la capacidad de unión.
En primer lugar, la unión no específica no se limita a los sitios de unión del anticuerpo en el soporte inmovilizado; cualquier superficie del anticuerpo o componente de la reacción de inmunoprecipitación puede unirse a constituyentes del lisado no específicos y, por lo tanto, la unión no específica seguirá produciéndose incluso cuando se utilicen perlas completamente saturadas. Por este motivo es importante aclarar previamente la muestra antes de realizar la inmunoprecipitación.
En segundo lugar, la capacidad de capturar la proteína diana depende directamente de la cantidad de anticuerpo inmovilizado utilizado y, por lo tanto, en una comparación lado a lado de la inmunoprecipitación con agarosa y con perlas magnéticas, la mayor cantidad de proteína que cualquiera de los soportes puede capturar está limitada por la cantidad de anticuerpo añadido. Entonces la decisión de saturar cualquier tipo de soporte depende de la cantidad de proteína requerida, como se describe arriba en la sección Agarosa de esta página.
El precio del uso de cualquiera de los tipos de soporte es un factor determinante clave en el uso de agarosa o perlas magnéticas para aplicaciones de inmunoprecipitación. Un cálculo típico a primera vista sobre el costo de las perlas magnéticas en comparación con las perlas de sefarosa puede hacer que las perlas de sefarosa parezcan menos costosas. Pero las perlas magnéticas pueden tener un precio competitivo en comparación con la agarosa para inmunoprecipitaciones a escala analítica, según el método IP utilizado y el volumen de perlas requerido por reacción IP.
Utilizando el método tradicional de inmunoprecipitación por lotes que se enumera a continuación, donde todos los componentes se agregan a un tubo durante la reacción IP, las características de manipulación física de las perlas de agarosa requieren una cantidad mínima de perlas para cada experimento IP (normalmente en el rango de 25 a 50 µl de perlas por IP). Esto se debe a que las perlas de sefarosa deben concentrarse en el fondo del tubo mediante centrifugación y el sobrenadante debe eliminarse después de cada incubación, lavado, etc. Esto impone limitaciones físicas absolutas al proceso, ya que los gránulos de perlas de agarosa de menos de 25 a 50 µl son difíciles. si no imposible, de identificar visualmente en el fondo del tubo. Con las perlas magnéticas, no se requiere una cantidad mínima de perlas debido al manejo magnético y, por lo tanto, dependiendo del antígeno diana y del anticuerpo IP, es posible utilizar considerablemente menos perlas magnéticas.
Por el contrario, se pueden emplear columnas de centrifugación en lugar de tubos de microcentrífuga normales para reducir significativamente la cantidad de perlas de agarosa necesarias por reacción. Las columnas de centrifugación contienen un filtro que permite que todos los componentes IP, excepto las perlas, fluyan mediante una breve centrifugación y, por lo tanto, proporcionan un método para utilizar significativamente menos perlas de agarosa con una pérdida mínima.
Como se mencionó anteriormente, solo se requiere equipo de laboratorio estándar para el uso de perlas de agarosa en aplicaciones de inmunoprecipitación, mientras que se requieren imanes de alta potencia para reacciones IP basadas en perlas magnéticas. Si bien el equipo de captura magnética puede tener un costo prohibitivo, completar rápidamente las inmunoprecipitaciones usando perlas magnéticas puede ser un enfoque financieramente beneficioso cuando vencen las subvenciones, porque un protocolo de 30 minutos con perlas magnéticas se compara con la incubación durante la noche a 4 °C con perlas de agarosa. puede dar lugar a que se generen más datos en un período de tiempo más corto. [7] [8] [9]
Un beneficio adicional del uso de perlas magnéticas es que los dispositivos de inmunoprecipitación automatizados están cada vez más disponibles. Estos dispositivos no sólo reducen la cantidad de trabajo y tiempo para realizar una IP, sino que también pueden usarse para aplicaciones de alto rendimiento .
Si bien los beneficios claros del uso de perlas magnéticas incluyen una mayor velocidad de reacción, un manejo más suave de las muestras y el potencial de automatización, la elección de usar agarosa o perlas magnéticas en función de la capacidad de unión del medio de soporte y el costo del producto puede depender del proteína de interés y el método IP utilizado. Como ocurre con todos los ensayos, se requieren pruebas empíricas para determinar qué método es óptimo para una aplicación determinada.
Una vez que se ha elegido la tecnología de perlas de sustrato sólido, los anticuerpos se acoplan a las perlas y las perlas recubiertas de anticuerpos se pueden agregar a la muestra de proteína heterogénea (por ejemplo, tejido homogeneizado). En este punto, los anticuerpos que están inmovilizados en las perlas se unirán a las proteínas que reconocen específicamente. Una vez que esto ha ocurrido, la parte del protocolo de inmunoprecipitación está realmente completa, ya que las proteínas específicas de interés se unen a los anticuerpos que a su vez están inmovilizados en las perlas. La separación de los inmunocomplejos del lisado es una serie de pasos extremadamente importante, porque las proteínas deben permanecer unidas entre sí (en el caso de co-IP) y unidas al anticuerpo durante los pasos de lavado para eliminar los no unidos. proteínas y reducir el fondo.
Cuando se trabaja con perlas de agarosa, las perlas se deben extraer de la muestra girándolas brevemente en una centrífuga con fuerzas entre 600 y 3000 xg (veces la fuerza gravitacional estándar). Este paso se puede realizar en un tubo de microcentrífuga estándar, pero para una separación más rápida, mayor consistencia y mayores recuperaciones, el proceso a menudo se realiza en pequeñas columnas de centrifugación con un tamaño de poro que permite el paso del líquido, pero no de las perlas de agarosa. Después de la centrifugación, las perlas de agarosa formarán un gránulo esponjoso muy suelto en el fondo del tubo. El sobrenadante que contiene contaminantes se puede eliminar con cuidado para no perturbar las perlas. A continuación se puede añadir el tampón de lavado a las perlas y, después de mezclarlas, las perlas se separan nuevamente mediante centrifugación.
Con perlas superparamagnéticas, la muestra se coloca en un campo magnético para que las perlas puedan acumularse en el costado del tubo. Este procedimiento generalmente se completa en aproximadamente 30 segundos y el líquido restante (no deseado) se pipetea. Los lavados se logran resuspendiendo las perlas (fuera del imán) con la solución de lavado y luego concentrando las perlas nuevamente en la pared del tubo (colocando el tubo nuevamente sobre el imán). El lavado generalmente se repite varias veces para asegurar la eliminación adecuada de los contaminantes. Si las perlas superparamagnéticas son de tamaño homogéneo y el imán se ha diseñado correctamente, las perlas se concentrarán uniformemente en el costado del tubo y la solución de lavado se podrá eliminar fácil y completamente.
Después del lavado, las proteínas precipitadas se eluyen y se analizan mediante electroforesis en gel , espectrometría de masas , transferencia Western o cualquier otro método para identificar los constituyentes del complejo. Los tiempos del protocolo para la inmunoprecipitación varían mucho debido a una variedad de factores, y los tiempos del protocolo aumentan con el número de lavados necesarios o con la cinética de reacción más lenta de las perlas de agarosa porosas.
Técnica de Co-Inmunoprecipitación (Co-IP)