El ensayo de ácido bicinconínico ( ensayo BCA ), también conocido como ensayo Smith , en honor a su inventor, Paul K. Smith de Pierce Chemical Company , [1] ahora parte de Thermo Fisher Scientific, es un ensayo bioquímico para determinar la concentración total de proteína en una solución (0,5 μg/mL a 1,5 mg/mL), similar al ensayo de proteína de Lowry , el ensayo de proteína de Bradford o el reactivo de Biuret . La concentración total de proteína se muestra mediante un cambio de color de la solución de muestra de azul a violeta en proporción a la concentración de proteína, que luego se puede medir utilizando técnicas colorimétricas . El ensayo BCA fue patentado por Pierce Chemical Company en 1989 y la patente expiró en 2006. [2]
Una solución madre de BCA contiene los siguientes ingredientes en una solución altamente alcalina con un pH de 11,25: ácido bicinconínico , carbonato de sodio , bicarbonato de sodio , tartrato de sodio y sulfato de cobre (II) pentahidratado.
El ensayo BCA se basa principalmente en dos reacciones. En primer lugar, los enlaces peptídicos de la proteína reducen los iones Cu 2+ del sulfato de cobre (II) a Cu 1+ (una reacción que depende de la temperatura). La cantidad de Cu 2+ reducida es proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución. A continuación, dos moléculas de ácido bicinconínico se quelan con cada ion Cu 1+ , formando un complejo de color púrpura que absorbe fuertemente la luz a una longitud de onda de 562 nm .
El complejo de ácido bicinconínico Cu 1+ se ve influenciado en las muestras de proteínas por la presencia de cadenas laterales de cisteína/cistina, tirosina y triptófano. A temperaturas más altas (37 a 60 °C), los enlaces peptídicos ayudan a la formación del complejo de reacción. Se recomienda incubar el ensayo de BCA a temperaturas más altas como una forma de aumentar la sensibilidad del ensayo y minimizar las variaciones causadas por la composición desigual de aminoácidos. [3]
La cantidad de proteína presente en una solución se puede cuantificar midiendo los espectros de absorción y comparándolos con soluciones de proteína de concentración conocida.
El ensayo BCA es en gran medida incompatible con agentes reductores y quelantes de metales, aunque se pueden tolerar cantidades traza. [4] Se informa que el ensayo BCA también responde a lípidos de membrana y fosfolípidos comunes. [5]
Existen algunas variantes alternativas del ensayo BCA:
Como lo describe Smith, [1] el ensayo BCA original es un protocolo de dos componentes. Los dos reactivos son "estables indefinidamente a temperatura ambiente". [1] Existen formulaciones modernas (probablemente exactas o muy similares) disponibles de al menos dos proveedores comerciales. [6] [7] La solución de trabajo BCA se genera mezclando el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 50:1 y se puede preparar semanalmente (es moderadamente estable) o según sea necesario.
Reactivo A [1]
Una formulación alternativa sugerida pero no probada en el manuscrito de Smith es omitir el NaOH (y presumiblemente no realizar el ajuste manual del pH a 11,25), sino disolver los otros componentes en un tampón preparado previamente de 0,25 M Na 2 CO 3 y 0,01 M NaHCO 3 . [1]
Cabe destacar que Smith sintetizó su propio BCA a través de la reacción de Pfitzinger de isatina y acetoína , sustituyendo NaOH por KOH pero siguiendo el método sintético de Lesene y Henze, [8] ya que el BCA disponible en los vendedores comerciales de ese momento era demasiado impuro para su uso. Se necesitaron al menos tres recristalizaciones sucesivas de su BCA sintetizado en agua a 70 °C para purificarlo lo suficiente para el ensayo. [1]
Reactivo B [1]
El ensayo BCA Micro BCA es un protocolo de 3 componentes que utiliza soluciones concentradas de la reacción de Biuret , BCA y reactivos de cobre (II) . Permite una sensibilidad mejorada de ~2 - 40 μg/mL frente a los 20 - 2000 μg/mL del ensayo BCA original. Sin embargo, tiene una interferencia diferente y, en términos generales, más sensible de los componentes no proteicos. [4] Los kits para el ensayo Micro BCA están disponibles en al menos dos proveedores comerciales. [9] [10] Cabe destacar que la composición y el uso de un "reactivo y protocolo Micro BCA" fueron descritos en el manuscrito original por Smith, [1] y los kits modernos probablemente consisten en una formulación exacta o muy similar. El protocolo consiste en mezclar el microreactivo B y la solución de cobre en proporción 25:1 para formar el microreactivo C (MC), que no es estable y debe prepararse en el momento, y luego mezclar el MC en proporción 1:1 con el microreactivo A para producir la solución de trabajo de ensayo final (también inestable). El microreactivo A, el microreactivo B y la solución de cobre son estables indefinidamente a temperatura ambiente. [1]
Micro-reactivo A (MA) [1]
Micro-reactivo B (MB) [1]
Solución de cobre [1]
Este tipo de ensayo BCA incluye un "reactivo de compatibilidad" de bloqueo covalente de tiol patentado [11], también conocido como agente de compatibilidad de agente reductor (RACA). [12] Aunque esto permite una mayor compatibilidad con los agentes reductores, el ensayo tiene un perfil de interferencia diferente al de otros componentes no proteicos. [4]
Este tipo de ensayo BCA parece estar disponible únicamente en Thermo Fisher Scientific . Según se informa, utiliza "el mismo método de reducción de cobre que el ensayo de proteínas BCA tradicional con un quelante de cobre exclusivo [propietario]", que absorbe a 480 nm en lugar de 562 nm. [13] Este quelante propietario y la formulación de reacción de Biuret presuntamente optimizada permiten que el ensayo proporcione resultados rápidos (<5 min) sin la incubación a 37 ˚C+ del ensayo BCA original. Sin embargo, el ensayo tiene un perfil de interferencia diferente al de otros componentes no proteicos. [4] El ensayo de péptidos colorimétrico cuantitativo Pierce (ahora propiedad de Thermo Fisher Scientific y disponible en él) parece utilizar un quelante de cobre patentado que absorbe a 480 nm similar o idéntico. [14]