El procesamiento de imágenes microscópicas es un término amplio que cubre el uso de técnicas de procesamiento de imágenes digitales para procesar, analizar y presentar imágenes obtenidas de un microscopio . Este procesamiento es ahora común en diversos campos como la medicina , la investigación biológica , la investigación del cáncer , las pruebas de fármacos , la metalurgia , etc. Varios fabricantes de microscopios ahora diseñan específicamente características que permiten a los microscopios conectarse a un sistema de procesamiento de imágenes. .
Hasta principios de la década de 1990, la mayor parte de la adquisición de imágenes en aplicaciones de microscopía de vídeo se realizaba normalmente con una cámara de vídeo analógica, a menudo simplemente cámaras de televisión de circuito cerrado. Si bien esto requería el uso de un capturador de fotogramas para digitalizar las imágenes, las cámaras de vídeo proporcionaban imágenes a una velocidad de fotogramas completa (25-30 fotogramas por segundo), lo que permitía la grabación y el procesamiento de vídeo en directo. Si bien la llegada de los detectores de estado sólido produjo varias ventajas, la cámara de vídeo en tiempo real fue en realidad superior en muchos aspectos.
Hoy en día, la adquisición se suele realizar mediante una cámara CCD montada en el camino óptico del microscopio. La cámara puede ser a todo color o monocromática. Muy a menudo se emplean cámaras de muy alta resolución para obtener la mayor cantidad de información directa posible. El enfriamiento criogénico también es común para minimizar el ruido. A menudo, las cámaras digitales utilizadas para esta aplicación proporcionan datos de intensidad de píxeles con una resolución de 12 a 16 bits, mucho mayor que la utilizada en productos de imágenes de consumo.
Irónicamente, en los últimos años se han puesto muchos esfuerzos en adquirir datos a velocidades de vídeo o superiores (25 a 30 fotogramas por segundo o más). Lo que alguna vez fue fácil con las cámaras de video disponibles en el mercado, ahora requiere dispositivos electrónicos especiales de alta velocidad para manejar el vasto ancho de banda de datos digitales.
La adquisición de mayor velocidad permite observar procesos dinámicos en tiempo real o almacenarlos para su posterior reproducción y análisis. Combinado con la alta resolución de la imagen, este enfoque puede generar grandes cantidades de datos sin procesar, lo que puede ser un desafío, incluso con un sistema informático moderno .
Cabe observar que, si bien los detectores CCD actuales permiten una resolución de imagen muy alta , a menudo esto implica una compensación porque, para un tamaño de chip determinado, a medida que aumenta el número de píxeles, el tamaño de los píxeles disminuye. A medida que los píxeles se hacen más pequeños, la profundidad de su pozo disminuye, lo que reduce la cantidad de electrones que se pueden almacenar. A su vez, esto da como resultado una peor relación señal-ruido .
Para obtener mejores resultados, se debe seleccionar un sensor apropiado para una aplicación determinada. Debido a que las imágenes microscópicas tienen una resolución limitante intrínseca, a menudo tiene poco sentido utilizar un detector ruidoso de alta resolución para la adquisición de imágenes. Un detector más modesto, con píxeles más grandes, a menudo puede producir imágenes de mucha mayor calidad debido a la reducción del ruido. Esto es especialmente importante en aplicaciones con poca luz, como la microscopía de fluorescencia .
Además, también se deben considerar los requisitos de resolución temporal de la solicitud. Un detector de menor resolución tendrá a menudo una tasa de adquisición significativamente mayor, lo que permitirá la observación de eventos más rápidos. Por el contrario, si el objeto observado está inmóvil, es posible que desee adquirir imágenes con la resolución espacial más alta posible sin tener en cuenta el tiempo necesario para adquirir una sola imagen.
El procesamiento de imágenes para aplicaciones de microscopía comienza con técnicas fundamentales destinadas a reproducir con mayor precisión la información contenida en la muestra microscópica. Esto podría incluir ajustar el brillo y el contraste de la imagen, promediar las imágenes para reducir el ruido de la imagen y corregir las irregularidades en la iluminación. Dicho procesamiento implica sólo operaciones aritméticas básicas entre imágenes (es decir, suma, resta, multiplicación y división). La gran mayoría del procesamiento realizado en imágenes microscópicas es de esta naturaleza.
Otra clase de operaciones 2D comunes denominada convolución de imágenes se utiliza a menudo para reducir o mejorar los detalles de la imagen. Estos algoritmos de "difuminación" y "nitidez" en la mayoría de los programas funcionan alterando el valor de un píxel en función de una suma ponderada de ese y los píxeles circundantes (una descripción más detallada de la convolución basada en el núcleo merece una entrada por sí misma) o alterando el dominio de la frecuencia. Función de la imagen mediante Transformada de Fourier . La mayoría de las técnicas de procesamiento de imágenes se realizan en el dominio de la frecuencia.
Otras técnicas bidimensionales básicas incluyen operaciones como rotación de imágenes, deformación, equilibrio de color, etc.
En ocasiones, se emplean técnicas avanzadas con el objetivo de "deshacer" la distorsión del camino óptico del microscopio, eliminando así las distorsiones y la borrosidad causada por la instrumentación. Este proceso se llama deconvolución , y se han desarrollado una variedad de algoritmos , algunos de gran complejidad matemática. El resultado final es una imagen mucho más nítida y clara que la que podría obtenerse únicamente en el dominio óptico. Esta suele ser una operación tridimensional que analiza una imagen volumétrica (es decir, imágenes tomadas en una variedad de planos focales a través de la muestra) y utiliza estos datos para reconstruir una imagen tridimensional más precisa.
Otro requisito común es tomar una serie de imágenes en una posición fija, pero a diferentes profundidades focales. Dado que la mayoría de las muestras microscópicas son esencialmente transparentes y la profundidad de campo de la muestra enfocada es excepcionalmente estrecha, es posible capturar imágenes "a través" de un objeto tridimensional utilizando equipos 2D como microscopios confocales . Luego, el software puede reconstruir un modelo 3D de la muestra original que puede manipularse adecuadamente. El procesamiento convierte un instrumento 2D en un instrumento 3D, que de otro modo no existiría. En los últimos tiempos esta técnica ha dado lugar a una serie de descubrimientos científicos en biología celular.
El análisis de imágenes variará considerablemente según la aplicación. El análisis típico incluye determinar dónde están los bordes de un objeto, contar objetos similares, calcular el área, la longitud del perímetro y otras medidas útiles de cada objeto. Un enfoque común es crear una máscara de imagen que solo incluya píxeles que coincidan con ciertos criterios y luego realizar operaciones de escaneo más simples en la máscara resultante. También es posible etiquetar objetos y seguir su movimiento a lo largo de una serie de fotogramas en una secuencia de vídeo.
Russ, John C. (19 de diciembre de 2006) [1992]. El manual de procesamiento de imágenes (5ª ed.). Prensa CRC. ISBN 0-8493-7254-2.