El análisis de partículas por imágenes es una técnica para realizar mediciones de partículas mediante imágenes digitales , una de las técnicas definidas por el término más amplio análisis del tamaño de partículas . Las mediciones que se pueden realizar incluyen el tamaño de las partículas , la forma de las partículas (morfología o análisis de la forma y escala de grises o color ), así como distribuciones (gráficos) de mediciones estadísticas de la población .
El análisis de partículas por imágenes utiliza las técnicas comunes al análisis de imágenes o al procesamiento de imágenes para el análisis de partículas. Las partículas se definen aquí según el análisis del tamaño de partícula como sólidos particulados, y por lo tanto no incluyen partículas atómicas o subatómicas. Además, este artículo se limita a imágenes reales (formadas ópticamente), a diferencia de las imágenes "sintéticas" (computarizadas) ( tomografía computarizada , microscopía confocal , SIM y otras técnicas de microscopía de súper resolución , etc.).
Teniendo en cuenta lo anterior, el método principal para el análisis de imágenes de partículas es el uso de microscopía óptica. Si bien los microscopios ópticos han existido y se han utilizado para el análisis de partículas desde el siglo XVII, [1] en el pasado el "análisis" lo realizaban seres humanos utilizando el sistema visual humano . Como tal, gran parte de este análisis es subjetivo o de naturaleza cualitativa. Incluso cuando se dispone de algún tipo de herramientas cualitativas, como una retícula de medición en el microscopio, todavía se ha requerido que un ser humano determine y registre esas mediciones.
A partir de finales del siglo XIX [2] , con la disponibilidad de placas fotográficas , se hizo posible capturar imágenes de microscopio de forma permanente en película o papel, lo que facilitó la adquisición de mediciones simplemente utilizando una regla escalada sobre la imagen impresa. Si bien esto aceleró significativamente la adquisición de mediciones de partículas, seguía siendo un proceso tedioso y laborioso, que no solo dificultaba la medición de poblaciones de partículas estadísticamente significativas, sino que también introducía cierto grado de error humano en el proceso.
Finalmente, a partir de finales de los años 1970, los sensores digitales CCD para capturar imágenes y las computadoras que podían procesar esas imágenes comenzaron a revolucionar el proceso mediante el uso de imágenes digitales . Aunque los algoritmos reales para realizar el procesamiento de imágenes digitales ya existían desde hacía algún tiempo, no fue hasta que la importante potencia de cálculo necesaria para realizar estos análisis estuvo disponible a precios razonables que las técnicas de imágenes digitales pudieron implementarse de manera generalizada. El primer sistema de análisis de partículas por imágenes dinámicas se patentó en 1982. [3] A medida que se disponía de recursos informáticos más rápidos a costos más bajos, la tarea de realizar mediciones a partir de imágenes de partículas en microscopio ahora podía realizarse automáticamente por máquina sin intervención humana, lo que hizo posible medir cantidades significativamente mayores de partículas en mucho menos tiempo.
El proceso básico mediante el cual se lleva a cabo el análisis de partículas por imágenes es el siguiente:
Los analizadores de partículas para imágenes se pueden subdividir en dos tipos distintos, estáticos y dinámicos, según los métodos de adquisición de imágenes. Si bien los principios básicos son los mismos, los métodos de adquisición de imágenes son de naturaleza diferente y cada uno tiene ventajas y desventajas.
La adquisición de imágenes estáticas es la forma más común. Casi todos los microscopios se pueden adaptar fácilmente para aceptar una cámara digital mediante un adaptador de montura C. Este tipo de configuración se conoce a menudo como microscopio digital , aunque muchos sistemas que utilizan ese nombre se utilizan únicamente para mostrar una imagen en un monitor .
La muestra se prepara en un portaobjetos de microscopio que se coloca en la platina del microscopio . Una vez que se ha enfocado la muestra, se puede adquirir una imagen y visualizarla en el monitor. Si se cuenta con una cámara digital o un capturador de imágenes , la imagen se puede guardar en formato digital y se pueden utilizar algoritmos de procesamiento de imágenes para aislar partículas en el campo de visión y medirlas. [11] [12]
En la adquisición de imágenes estáticas, solo se captura una imagen del campo de visión a la vez. Si el usuario desea obtener imágenes de otras partes de la misma muestra en el portaobjetos, puede utilizar el hardware de posicionamiento XY (normalmente compuesto por dos plataformas lineales en el microscopio) para moverse a un área diferente del portaobjetos. Se debe tener cuidado de asegurar que dos imágenes no se superpongan para no contar y medir las mismas partículas más de una vez.
El principal inconveniente de la adquisición de imágenes estáticas es que requiere mucho tiempo, tanto en la preparación de la muestra (colocar la muestra en el portaobjetos con la dilución adecuada si es necesario) como en los múltiples movimientos de la platina para poder adquirir una cantidad estadísticamente significativa de partículas para contar/medir. En ocasiones, en estos sistemas se utilizan platinas de posicionamiento XY controladas por computadora para acelerar el proceso y reducir la cantidad de intervención del operador, pero sigue siendo un proceso que requiere mucho tiempo y las platinas motorizadas pueden ser costosas debido al nivel de precisión requerido cuando se trabaja con un gran aumento. [13]
Las principales ventajas de los sistemas de obtención de imágenes de partículas estáticas son el uso de sistemas de microscopio estándar y la simplicidad de las consideraciones de profundidad de campo . Dado que estos sistemas se pueden fabricar a partir de cualquier microscopio óptico estándar, pueden ser un enfoque de menor costo para las personas que ya tienen microscopios. Sin embargo, lo más importante es que los sistemas basados en microscopios tienen menos problemas de profundidad de campo en general en comparación con los sistemas de obtención de imágenes dinámicas. Esto se debe a que la muestra se coloca en un portaobjetos de microscopio y luego generalmente se cubre con un cubreobjetos , lo que limita el plano que contiene las partículas en relación con el eje óptico . Esto significa que habrá más partículas en un enfoque aceptable a grandes aumentos. [13]
En la adquisición de imágenes dinámicas, se obtienen imágenes de grandes cantidades de muestra moviendo la muestra más allá de la óptica del microscopio y utilizando una iluminación de flash de alta velocidad para "congelar" eficazmente el movimiento de la muestra. El flash está sincronizado con una alta velocidad de obturación en la cámara para evitar aún más el desenfoque por movimiento. En un sistema de partículas secas, las partículas se dispensan desde una mesa vibratoria y caen por gravedad más allá del sistema óptico. En los sistemas de análisis de partículas de imágenes de fluidos, el líquido pasa a través del eje óptico mediante el uso de una celda de flujo estrecha, como se muestra a la derecha.
La celda de flujo se caracteriza por su profundidad perpendicular al eje óptico, como se muestra en el segundo diagrama de la derecha. Para mantener las partículas enfocadas, la profundidad del flujo se restringe de modo que las partículas permanezcan en un plano de mejor enfoque perpendicular al eje óptico. Esto es similar en concepto al efecto del portaobjetos más el cubreobjetos en un sistema de imágenes estáticas. Dado que la profundidad de campo disminuye exponencialmente con el aumento, la profundidad de la celda de flujo debe reducirse significativamente con aumentos mayores.
El principal inconveniente de la adquisición de imágenes dinámicas es que la profundidad de la celda de flujo debe limitarse como se ha descrito anteriormente. Esto significa que, en general, no se pueden permitir partículas de un tamaño superior a la profundidad de la celda de flujo en la muestra que se está procesando, ya que probablemente obstruirán el sistema. Por lo tanto, la muestra normalmente tendrá que filtrarse para eliminar partículas de un tamaño superior a la profundidad de la celda de flujo antes de evaluarla. Si se desea observar un rango muy amplio de tamaños de partículas, esto puede significar que la muestra tendría que fraccionarse en componentes de un rango de tamaño más pequeño y procesarse con diferentes combinaciones de aumento/celda de flujo. [13]
La principal ventaja de la adquisición de imágenes dinámicas es que permite adquirir y medir partículas a una velocidad significativamente mayor, normalmente del orden de 10.000 partículas/minuto o más. Esto significa que se pueden analizar poblaciones estadísticamente significativas en períodos de tiempo mucho más cortos que los que antes eran posibles con la microscopía manual o incluso con el análisis de partículas mediante imágenes estáticas. En este sentido, los sistemas de análisis de partículas mediante imágenes dinámicas combinan la velocidad típica de los contadores de partículas con las capacidades discriminatorias de la microscopía. [13]
El análisis de partículas mediante imágenes dinámicas se utiliza en la investigación de microorganismos acuáticos para analizar fitoplancton, zooplancton y otros microorganismos acuáticos que varían de tamaño entre 2 um y 5 mm. El análisis de partículas mediante imágenes dinámicas también se utiliza en la investigación biofarmacéutica para caracterizar y analizar partículas que varían de tamaño entre 300 nm y 5 mm.
La obtención de imágenes de microflujo (MFI) es una técnica de análisis de partículas que utiliza la microscopía de flujo para cuantificar las partículas contenidas en una solución en función de su tamaño. Esta técnica se utiliza en la industria biofarmacéutica para caracterizar partículas subvisibles de aproximadamente 1 μm a >50 μm. [14]