Perlecan [5] (PLC), también conocido como proteína del núcleo del proteoglicano de sulfato de heparán específico de la membrana basal (HSPG) o proteoglicano de sulfato de heparán 2 ( HSPG2 ), es una proteína que en los humanos está codificada por el gen HSPG2 . [6] [7] [8] [9] El gen HSPG2 codifica una proteína de 4.391 aminoácidos con un peso molecular de 468.829. Es una de las proteínas más grandes conocidas. El nombre perlecan proviene de su apariencia como un "collar de perlas" en imágenes sombreadas rotatorias.
El perlecano se aisló originalmente de una línea de células tumorales y se demostró que está presente en todas las membranas basales nativas. [10] El perlecano es un gran proteoglicano multidominio (cinco dominios, etiquetados IV) [5] que se une y reticula muchos componentes de la matriz extracelular (ECM) y moléculas de la superficie celular . [11] El perlecano es sintetizado tanto por células endoteliales vasculares como por células musculares lisas y se deposita en la matriz extracelular de los parahoxozoos . [12] El perlecano está altamente conservado en todas las especies y los datos disponibles indican que ha evolucionado a partir de ancestros antiguos por duplicación genética y redistribución de exones . [11]
El perlecano consiste en una proteína central de peso molecular 469 kDa a la que se unen tres cadenas largas (cada una de aproximadamente 70-100 kDa) de glicosaminoglicanos (a menudo heparán sulfato , HS, pero puede ser condroitín sulfato , CS). La proteína central consta de cinco dominios estructurales distintos . El dominio I N-terminal ( aa ~1-195) contiene sitios de unión para cadenas HS. [13] Aunque las cadenas HS no son necesarias para el plegamiento y secreción correctos de la proteína, la falta de HS o la sulfatación disminuida pueden disminuir la capacidad del perlecano para interactuar con las proteínas de la matriz . La eliminación de las cadenas HS puede afectar la organización de la matriz y la función de barrera endotelial . El dominio II comprende cuatro repeticiones homólogas a la porción de unión al ligando del receptor de LDL con seis residuos de cisteína conservados y un pentapéptido, DGSDE, que media la unión del ligando por el receptor de LDL. El dominio III tiene homología con el dominio IVa y IVb de la laminina . El dominio IV consta de una serie de módulos IG . La estructura de solo la tercera repetición similar a inmunoglobulina (IG) en el dominio IV se muestra en la figura denominada "HSPG2". El dominio V C-terminal , que tiene homología con el dominio G del brazo largo de la laminina , es responsable del autoensamblaje y puede ser importante para la formación de la membrana basal in vivo. El dominio V también tiene sitios de unión para cadenas HS/CS. [14] Por lo tanto, la proteína central de perlecano y las cadenas HS podrían modular el ensamblaje de la matriz, la proliferación celular , la unión de lipoproteínas y la adhesión celular .
El perlecano es un componente clave de la matriz extracelular del cartílago [15] donde es esencial para el desarrollo normal de la placa de crecimiento y el crecimiento de los huesos largos . [16] [17] El enanismo exhibido por el ratón nulo de perlecano se asemeja al fenotipo producido por mutaciones activadoras en el gen para FGFR3 , [18] un receptor para factores de crecimiento de fibroblastos . El perlecano se une a los factores de crecimiento involucrados en el desarrollo de la placa de crecimiento. Se ha demostrado que el perlecano aislado de las placas de crecimiento en desarrollo se une a FGF-2 a través de sus cadenas laterales de sulfato de heparán, [19] y a FGF-18 a través del dominio III de su proteína central [20] y media su acción sobre los receptores de FGF. Es probable que el perlecano desempeñe un papel crítico en el secuestro y/o suministro de FGF-2 y FGF-18 durante la osificación endocondral .
El perlecan también es un componente clave de la matriz extracelular vascular, donde interactúa con una variedad de otros componentes de la matriz y ayuda a mantener la función de barrera endotelial. El perlecan es un potente inhibidor de la proliferación de células musculares lisas y, por lo tanto, se cree que ayuda a mantener la homeostasis vascular. El perlecan también puede promover la actividad del factor de crecimiento (p. ej., FGF-2 ) y, por lo tanto, estimular el crecimiento y la regeneración endotelial.
Las modificaciones de las cadenas de heparán sulfato en los dominios C y N-terminales son las diferencias mejor estudiadas en la vía secretora del perlecano. El sulfato de condroitina puede sustituirse por sulfato de heparán, y la incorporación de sulfato o la composición de azúcar de las cadenas pueden cambiar. La pérdida de enzimas implicadas en la vía sintética del sulfato de heparán conduce a una serie de enfermedades.
La modificación diferencial de la cadena de heparán sulfato puede ocurrir a través de una serie de señales reguladoras. El perlecano en la placa de crecimiento de los huesos largos del ratón muestra cambios de glicosilación en la progresión de los condrocitos desde la zona de reposo a la zona de proliferación. [21] Aunque inicialmente se pensó que las cadenas de glicosaminoglicano (GAG) del perlecano eran exclusivamente de heparán sulfato, [10] las cadenas de sulfato de condroitina pueden sustituirse [13] y esto puede depender del tipo de célula. Al expresar una forma recombinante del dominio I N-terminal de la proteína y demostrar que la digestión del péptido con heparanasa o condroitinasa no condujo a la pérdida completa de la actividad del péptido, se demostró que las cadenas de sulfato de condroitina pueden agregarse al perlecano humano. [22] Esto concordaba con datos previos que mostraban cadenas GAG de sulfato de condroitina unidas al perlecano bovino producido por los condrocitos [15] y que la proteína del dominio I humana recombinante estaba glicosilada con cadenas de heparán y sulfato de condroitina cuando se expresaba en células de ovario de hámster chino. [23] La adición preferencial de cadenas de heparán sulfato o de condroitina sulfato a los dominios I y V podría tener un efecto en la diferenciación de tejidos mesenquimales en cartílago, hueso o cualquier número de tejidos, pero el mecanismo regulador del cambio de la adición de heparán sulfato a la de condroitina sulfato no se entiende bien.
Al estudiar el efecto de la composición de proteoglicanos en la permeselectividad nefrítica , se observó que el tratamiento con puromicina de células endoteliales glomerulares humanas (HGEC) alteró el nivel de sulfatación de las cadenas de GAG en proteoglicanos como el perlecano, lo que a su vez causó una disminución en la estabilidad de las cadenas de GAG. Los niveles de ARNm de la proteína central de los proteoglicanos no se vieron afectados, por lo que la disminución de las cadenas de GAG fue el resultado de algún otro factor, que en este caso resultó ser una disminución en la expresión de las enzimas transferasas de sulfato , que desempeñan un papel clave en la biosíntesis de GAG. [24] Parece que puede haber cierta superposición en las enfermedades derivadas de la pérdida de la expresión del proteoglicano de heparán sulfato y la pérdida de enzimas involucradas en la biosíntesis de heparán sulfato.
Las células pueden modificar su matriz extracelular y sus membranas basales en respuesta a señales o estrés. Las proteasas específicas actúan sobre la proteína en el entorno extracelular cuando las células tienen una razón para moverse o cambiar su entorno. La catepsina S es una proteasa de cisteína que atenúa moderadamente la unión de las células positivas para FGF a un sustrato positivo para perlecano. La catepsina S es una proteasa potencial que actúa sobre la proteína central de perlecano en la membrana basal o el estroma. [25]
Las cadenas de heparán sulfato de perlecano se unen a factores de crecimiento en la matriz extracelular y sirven como coligandos o potenciadores de ligandos cuando se unen a receptores. Otro estudio mostró que la liberación de FGF básico unido a HS en cultivo podría lograrse mediante el tratamiento con estromelisina, heparitinasa I, colagenasa de rata y plasmina, [26] y estos sitios de proteólisis se ilustran en la figura 1. Esto se propuso como una lista no exhaustiva de las proteasas que podrían mediar la liberación de factores de crecimiento de las cadenas de heparán sulfato de perlecano. Aunque Whitelock et al. sugirieron que existen secuencias de consenso de escisión de trombina en la proteína central de perlecano, también postulan que cualquier activación de perlecano por trombina en realidad proviene de la escisión de otros constituyentes de la matriz extracelular. Este artículo afirma que la heparanasa es responsable de la escisión de las cadenas de heparán sulfato de perlecano en la matriz. Esto libera factores de crecimiento unidos al heparán sulfato, específicamente FGF-10 . La adición de heparanasa al cultivo de células epiteliales en la membrana basal provocó un aumento en la proliferación de células epiteliales debido a la liberación de FGF-10. [27]
En un modelo de crecimiento de explantes in vitro utilizando epitelio corneal, la expresión de la metaloproteinasa de matriz (MMP) 2 se correlaciona con una degradación inicial de la membrana basal original. La reformación de la membrana basal en cultivo dependía de una regulación positiva inicial seguida de una regulación negativa de la MMP-9, en contraste con la expresión constante de la MMP-2. Esto no es evidencia de que la MMP-2 y la MMP-9 escindan directamente la proteína perlecan in vivo, pero muestra que las proteínas modulan claramente algún factor en la maduración de la membrana basal. [28] Otra familia de metaloproteasas, la familia de la proteína morfogenética ósea 1/similar a Tolloid, libera el dominio de endorrepellina c-terminal de la proteína central del perlecan. El dominio globular similar a la laminina contiene el motivo activo de la endorrepellina y no puede ser escindido por células que expresan formas mutantes e inactivas de las proteínas BMP-1. Además, el residuo crítico necesario para que se produzca esta escisión se localizó en Asp4197. [29] Este proceso proteolítico puede tener importancia en la enfermedad, ya que se encontró un fragmento correspondiente en la orina de pacientes que sufrían insuficiencia renal terminal [30] y en el líquido amniótico de mujeres embarazadas que habían sufrido una ruptura prematura de la membrana. [31]
El momento de la expresión genética durante el desarrollo varía de un tejido a otro. Las membranas basales suelen ser la fuerza impulsora que separa el epitelio del estroma y el tejido conectivo. El perlecano es de particular importancia en el desarrollo cardiovascular, neural y cartilaginoso.
El desarrollo del blastocisto antes de la implantación es una cascada controlada de regulación genética y señalización intercelular. Se ha observado perlecan extracelular en la etapa de blastocisto del desarrollo embrionario del ratón, específicamente regulado positivamente en el punto en el que el embrión alcanza la “competencia de unión”. [32] Este hallazgo se confirmó tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína, demostrado por RT-PCR e inmunotinción. El desarrollo embrionario posterior está regulado con la misma precisión que el desarrollo antes de la implantación, y es más complicado debido a la diferenciación de todos los tejidos. El primer estudio de la expresión de perlecan durante el desarrollo embrionario encontró que la proteína se expresó primero durante el desarrollo del sistema cardiovascular, y luego se correlaciona con la maduración de la mayoría de los tejidos del cuerpo, es decir, la separación de las capas epiteliales de los endotelios y el estroma por las membranas basales. [33] Nuevamente, esta regulación positiva durante el desarrollo cardiovascular es concomitante con el papel del extremo C del perlecan como endorrepelina.
La especificidad espacio-temporal en la transactivación del gen perlecan durante el desarrollo es clave para la maduración de las membranas basales y, por lo tanto, para la separación completa de los epitelios de los endotelios y el estroma. Un estudio exhaustivo de la expresión de perlecan durante el desarrollo del embrión de pollo ha demostrado que el perlecan está presente en la etapa de mórula y durante el resto del desarrollo, aunque la expresión puede ser transitoria y cronometrada con precisión en ciertos predecesores de tejidos. [34] En el embrión de rata, se ha demostrado que la expresión de perlecan aumenta en las células musculares lisas vasculares (VSMC) después de e19 en el desarrollo fetal. Esto se correlaciona perfectamente con el cese de la proliferación de VSMC en e18 y un cambio en su fenotipo. La teoría presentada en este estudio es que el perlecan desempeña un papel antiproliferativo para las VSMC una vez que se alcanza un cierto punto de desarrollo, de manera muy similar a la expresión dependiente de la confluencia de perlecan en cultivo. [35] Estos hallazgos fueron corroborados por resultados similares obtenidos en estudios de la arteria pulmonar y el epitelio pulmonar de ratas. También se descubrió que estos tejidos comienzan a producir perlecan una vez que la división celular había cesado, alrededor del día fetal 19. [36]
El desarrollo del sistema nervioso y la extensión de los axones está dirigido con precisión por señales de las moléculas de la matriz extracelular. El crecimiento de las neuritas olfativas en el desarrollo del ratón está guiado al menos en parte por una matriz extracelular formada por células epiteliales olfativas (CEO). El perlecano y la laminina-1 parecen ser importantes en esta vía de guía, aunque la inducción del perlecano ocurre un poco más tarde que la de la laminina-1. [37] Estos datos están respaldados por datos anteriores que muestran que las CEO expresan FGF-1 durante el desarrollo olfativo, y que el perlecano puede estimular el crecimiento de las neuritas sensoriales olfativas en cultivo en presencia de FGF-1. [38] El perlecano también mostró propiedades adhesivas para los nervios en un estudio anterior, lo que sugiere además que puede actuar en un papel atractivo en combinación con la laminina en lugar de uno repulsivo. [39]
Se ha demostrado que el desarrollo del cartílago y del hueso depende de la expresión de perlecano. [16] La proteína se hace visible mediante inmunotinción el día 15 durante el desarrollo del ratón, independientemente de otras proteínas de la membrana basal, lo que sugiere que es simplemente una parte de la matriz extracelular de los condrocitos en desarrollo, además del colágeno II y otros marcadores del cartílago que se expresan a partir del día 12. [40] Teniendo en cuenta los datos [41] de que los ratones que carecen del gen pln no pueden mantener un cartílago estable, es evidente que el perlecano es esencial para la maduración y la estabilidad de la estructura cartilaginosa. Esto está respaldado por un estudio que muestra que la supresión de la producción de perlecano inhibe las etapas finales de la diferenciación condrógena en fibroblastos C3H10T1/2 en cultivo. [42] El desarrollo óseo, es decir, la mineralización del tejido cartilaginoso, se correlaciona con la pérdida de perlecano y sulfato de heparán en la unión condroósea (UCO). [43] [44] En un esfuerzo por comprender cómo el heparán sulfato y el perlecano dirigen a las células madre mesenquimales hacia la vía osteogénica, se trataron células madre mesenquimales humanas con heparanasa y condroitinasa en cultivo. Esto condujo a una mayor mineralización y expresión de marcadores de osteocitos, lo que respalda los datos que muestran que la pérdida de heparán sulfato en la unión articular es un factor clave en la osteogénesis. [45] Se cree que la fuerza impulsora detrás de la activación de la osteogénesis por heparanasa y condroitinasa es la liberación de proteína morfogenética ósea unida a las cadenas de heparán sulfato.
La inhibición de la expresión de perlecano en embriones de pez cebra se ha logrado mediante el uso de morfolinos dirigidos a la transcripción de perlecano. Los morfolinos se utilizaron para bloquear la traducción del ARNm de perlecano en embriones de pez cebra, como parte de una investigación sobre la función del perlecano en el desarrollo esquelético y vascular. El morfolino se dirige a la región no traducida principal cinco del ARNm de perlecano, bloqueando así la traducción del mensaje. [46] La pérdida de la proteína perlecano en estos peces provocó graves miopatías y problemas de circulación. Como se demostró en un estudio posterior del mismo laboratorio, este fenotipo podría ser rescatado mediante la adición de VEGF-A exógeno. [47]
La importancia del perlecan para el desarrollo de los mamíferos se demuestra mediante experimentos de eliminación del gen perlecan. [16] [41] Casi la mitad de todos los ratones en los que se ha eliminado el gen perlecan (ratones nulos de perlecan) mueren en el día embrionario 10,5, cuando el gen perlecan comienza a expresarse normalmente. [48] Otros mueren justo después del nacimiento con defectos graves como la formación anormal de la membrana basal , el desarrollo defectuoso de la cabeza y los huesos largos y la acondroplasia . [41] [16] La estrategia de eliminación empleada para una de las eliminaciones de perlecan [41] [40] fue una floxación del exón 6 mediante la inserción de un casete de neomicina y la posterior expresión de CRE para la eliminación del exón 6 del genoma. Esto dio como resultado el fenotipo de compromiso del cartílago discutido anteriormente y la pérdida de la integridad de la membrana basal en una variedad de tejidos. La tasa de mortalidad fetal es alta y el ratón que sobrevive muere poco después del nacimiento. Se creó un modelo de ratón knock out de perlecan desarrollado por separado mediante la inserción de un casete de neomicina en el exón 7 del gen perlecan. [16] Estos ratones knock out también tuvieron una letalidad embrionaria del 40%, y el resto de los ratones murieron poco después del nacimiento debido a graves anomalías esqueléticas. El fenotipo knock out de perlecan en ambos estudios fue idéntico y similar al fenotipo producido por mutaciones activadoras en el gen para FGFR3, [18] un receptor para factores de crecimiento de fibroblastos.
En otro modelo de ratón knock-out, el gen perlecan fue mutado por recombinación homóloga del gen perlecan endógeno con un constructo que contenía brazos de homología de 2 y 5 kb que rodeaban un exón 3 eliminado, [49] que codifica 2 de los 3 sitios de unión de heparán sulfato en el dominio I [13] de perlecan. Sin embargo, el perlecan producido por fibroblastos cultivados de ratones knock-out del exón 3 contenía 40% de heparán sulfato y 60% de condroitín sulfato [50] porque, además del sitio de unión de heparán sulfato restante en el dominio I, el sitio de unión en el dominio V [14] también seguiría presente. El estudio mostró que los ratones knock-out del exón 3 tuvieron un colapso de la integridad de la cápsula del cristalino en la semana 3 posnatal, lo que indica un papel para los aminoácidos eliminados del dominio I de perlecan en el mantenimiento de la integridad de la membrana basal de la cápsula del cristalino. [49] Sin embargo, a diferencia de los ratones knock-out de perlecan, la viabilidad y el crecimiento de los huesos largos en los ratones knock-out del exón 3 fue normal. Esto sugiere que, en el ratón knock-out del exón 3, los sitios de unión restantes para el sulfato de heparán en los dominios I y V disponibles para la unión de FGF-2 [19] o el sitio en el dominio 3 disponible para la unión de FGF-18 [20] pueden ser suficientes para el crecimiento normal de los huesos largos.
Los cambios en el cristalino en los ratones knock out del exón 3 son algo similares a los del modelo de ratón knock out de TGF-β. [51] [52] Los ratones knock out del exón 3 también mostraron una disminución de la capacidad de cicatrización de heridas y angiogénesis cuando se los desafía con una lesión epidérmica o con la adición de FGF-2 a la córnea. [53] En el estudio de la lesión epidérmica, se creó una herida que abarcaba la profundidad de la epidermis en ratones negativos al exón 3 y ratones de control, y en los ratones knock out la angiogénesis y las características de la cicatrización de heridas se desarrollaron lentamente, posiblemente debido a una disminución del secuestro del factor de crecimiento por el perlecan negativo al heparán sulfato. Se produjo un resultado similar en el ensayo de microbolsillo corneal, donde se implanta FGF-2 en la córnea de ratones y en ratones normales se induce la angiogénesis. En los ratones knock out este efecto angiogénico se vio afectado, aunque no por completo.
Se utilizó un constructo de perlecan de longitud completa, bajo el control del promotor de colágeno tipo II, para crear un ratón transgénico de perlecan. [54] El promotor de colágeno tipo II permitió la expresión de perlecan en la matriz extracelular creada únicamente por los condrocitos, pero no en las membranas basales creadas por las células endoteliales, epiteliales o musculares. El transgén de perlecan en el ratón sin perlecan eliminó la letalidad y restableció el crecimiento de los huesos largos a la normalidad. Esto sugiere que el perlecan desempeña un papel fundamental en el desarrollo del cartílago. Sin embargo, los ratones transgénicos de perlecan exhibieron hipertrofia muscular, [55] lo que indica un papel del perlecan en el desarrollo muscular, así como en el crecimiento de los huesos largos mediado por la placa de crecimiento del cartílago.
Los estudios realizados en ratones con genes inactivados y en enfermedades humanas también han revelado funciones in vivo críticas del perlecan en el desarrollo del cartílago [56] y en la actividad de la unión neuromuscular. [17]
Las vías de señalización funcionan para elevar o disminuir los niveles de transcripción de genes, lo que a su vez hace que las células cambien su perfil de expresión génica. El efecto final de las vías de señalización se ejerce sobre el promotor de los genes, que puede incluir elementos aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción, algunos de los cuales pueden existir dentro del propio gen transcrito. Varias moléculas de señalización pueden producir cambios en la expresión de perlecan, incluidas las familias de moléculas del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), la interleucina (IL) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
Se estudiaron las 2,5 kilobases anteriores de la región promotora de perlecan mediante la activación de CAT en líneas celulares de diversos orígenes histológicos. [57] Este estudio concluyó que existía un elemento sensible a TGF-β en el promotor a sólo 285 pares de bases antes del sitio de inicio de la transcripción. Este resultado se ha corroborado en tejidos como las células de carcinoma de colon humano. [58] y el epitelio uterino murino [59] mediante la adición in vitro de la citocina al medio de cultivo celular. Los estudios in vitro de la señalización de TGF-β1 y sus efectos sobre la expresión de perlecan pueden tener resultados variables en diferentes tipos de células. En las células musculares lisas coronarias humanas en cultivo, la señalización de TGF-β1 no mostró ningún efecto sobre la expresión de perlecan aunque sí sobreexpresó otros constituyentes de la matriz. [60] La demostración in vivo de la regulación dinámica de perlecan y su control por vías de señalización extracelular es fundamental para nuestra comprensión del papel de la proteína en el desarrollo. Para ello, se creó una línea de ratones transgénicos que expresaban TGF-β1 porcino bajo el promotor αA-cristalina específico del cristalino [51] y luego se creó otra línea similar pero con el gen controlado por el promotor βb-cristalina, correspondiente a otro gen específico del cristalino. [52] Este tejido dinámico en términos de desarrollo mostró una grave desregulación de los componentes de la matriz extracelular, incluido el perlecano, con sobreexpresión de TGF-β1. La opacificación corneal se produjo en ambas líneas transgénicas al principio del desarrollo debido a una expresión muy aumentada de perlecano, fibronectina y trombospondina-1 en el mesénquima corneal. El efecto fue más pronunciado en la línea controlada por el promotor βB-1 Cristalina.
La familia IL de citocinas inflamatorias también regula positivamente la transcripción pln. En un modelo de ratón de formación de placa de Alzheimer, IL-1-alfa produce un aumento en la expresión de perlecano en respuesta a una lesión cerebral. [61] El tratamiento con IL-4 de fibroblastos gingivales humanos en cultivo condujo a un aumento de la producción de varios proteoglicanos de sulfato de heparán, incluido el perlecano. [62] El tratamiento de fibroblastos pulmonares humanos in vitro con IL-1-beta no condujo a ningún aumento significativo en la producción de perlecano. [63]
Otra vía de señalización que se ha demostrado que aumenta la transcripción de pln es la vía VEGF. El tratamiento con VEGF165 de células endoteliales microvasculares cerebrales humanas en cultivo estimula el aumento de la transcripción de pln. Esta molécula es un ligando del receptor VEGF-2 (VGFR2), y parece que esta respuesta de VEGF165 es específica para la regulación positiva de perlecan, lo que conduce a un ciclo de retroalimentación positiva que involucra al factor de crecimiento fibroblástico (FGF), al receptor de FGF (FGFR) y a VEGFR2 en respuesta al daño endotelial. Esta regulación específica microvascular por VEGF165 plantea la posibilidad de que la función anticoagulante de perlecan sea parte del proceso de control de daños en los endotelios cerebrales. [64]
La señalización de la proteína quinasa C es supuestamente responsable de la regulación positiva de la transcripción y la traducción de ciertos proteoglicanos, incluido el perlecano. Cuando la vía endocítica de las células HeLa se inhibe por la sobreexpresión de una dinamina mutante, la proteína quinasa C se activa y el mensaje y la proteína del perlecano aumentan posteriormente. [65] En cambio, la regulación negativa habitual del perlecano en respuesta a la hiperglucemia se pierde en ratones negativos para PKC-α. [66]
La señalización del interferón-γ media la represión transcripcional del gen perlecan. [67] Esto se demostró primero en líneas celulares de cáncer de colon, y posteriormente en líneas celulares de otros orígenes tisulares, pero en cada caso se requirió el factor de transcripción STAT1 intacto para que la señal surtiera efecto. Esto llevó a los investigadores a creer que el factor de transcripción STAT1 estaba interactuando con el promotor Pln en la región distal, localizado a 660 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción. [67] El tratamiento con interferón-γ de embriones murinos en etapa de blastocisto conduce a una pérdida de la expresión de perlecan en el trofectodermo, y por lo tanto una morfología y fenotipo embrionarios en cultivo celular, lo que sugiere que estos blastocistos tratados con interferón-γ serían defectuosos en la implantación. [68] Presumiblemente, la pérdida de la expresión de perlecan se debe a la regulación negativa de la transcripción a través de la actividad del factor de transcripción STAT1 como se mostró anteriormente. Estos resultados in vitro no son necesariamente representativos de las concentraciones fisiológicas normales de interferón-γ, ni tampoco la citocina se expresa de forma amplia, sino en momentos muy específicos del desarrollo. Es importante señalar que la expresión de perlecan puede disminuir mediante el tratamiento con una citocina exógena, como el interferón-γ, y si se produjera un aumento fisiológicamente anormal en la expresión de la citocina, podría interferir en la implantación.
El estrés mecánico y químico puede dañar las membranas basales o las células que las sostienen. Esto podría influir en el perfil de expresión genética de las células, especialmente en su matriz extracelular, que a menudo proporciona soporte físico y una barrera química para las células. Se ha estudiado la hipoxia, la inflamación, el estrés mecánico y químico para determinar su relación con la expresión del perlecano.
La hipoxia es una condición que se presenta en estados patológicos y durante lesiones y que a menudo resulta en una falta de proliferación de células endoteliales. Esto y el papel del perlecan como endorrepellina impulsaron un estudio sobre la naturaleza de la regulación de la expresión de perlecan por las células endoteliales durante condiciones hipóxicas. [69] En condiciones hipóxicas, este estudio encontró que la expresión de perlecan por las células endoteliales microvasculares cardíacas de ratas disminuyó un sesenta y uno por ciento en comparación con los controles normales. El argumento de este artículo es que la regulación negativa de perlecan conduce a una pérdida de la activación de FAK y, por lo tanto, a una menor señalización de ERK, lo que conduce a una disminución de la proliferación celular. Parece contradictorio que las células endoteliales proliferen menos rápidamente debido a la pérdida de perlecan y su subunidad endorrepellina. Podría ser que estas células endoteliales simplemente regularan negativamente la transcripción de muchos genes en respuesta a condiciones hipóxicas. En otro estudio, la hipoxia condujo a la inducción de genes asociados con la apoptosis y la muerte celular, pero la represión de los genes no se limitó a las proteínas asociadas con una vía específica. [70] Cuando las células epiteliales intestinales T84 se exponen a condiciones hipóxicas durante 24 horas, se produce un aumento significativo en la producción de ARNm y proteína de perlecan. [71] Relacionan esto con el hecho de que muchos genes elevados en respuesta a la hipoxia contienen un elemento de respuesta a AMPc (CRE) en su promotor, al igual que pln. Esta diferencia entre las células endoteliales del estudio de 2007 y la célula epitelial estudiada en estos experimentos es indicativa de cuán variados pueden ser los mecanismos reguladores de perlecan en diferentes tipos de células.
El desarrollo de placas de beta-amiloide en el cerebro está asociado con la aparición de la enfermedad de Alzheimer. Estas placas inducen un estado constante de inflamación en las áreas de acumulación, lo que lleva a la expresión de ciertos productos genéticos relacionados con la inflamación, algunos de los cuales perpetúan la inflamación en el contexto cerebral. Como se mencionó anteriormente, para investigar el efecto de la inflamación cerebral en los niveles de expresión de perlecan, se crearon heridas con agujas en cerebros de ratones y, después de la inflamación y períodos variables de recuperación, se evaluaron los niveles de ARNm y proteína mediante hibridación in situ e inmunotinción. Los niveles de perlecan aumentaron en el hipocampo pero no en el cuerpo estriado durante el período de curación, junto con la expresión de IL 1-alfa. [61] La expresión de perlecan se rastreó hasta las células microgliales en el hipocampo y los astrocitos. Este papel del perlecan en la generación de placas de beta-amiloide está respaldado por un estudio anterior que muestra que el tratamiento con perlecan y beta-amiloide de cerebros de ratas condujo a la formación de placas seniles, mientras que el tratamiento con beta-amiloide solo no tuvo el mismo efecto. [72]
A nivel orgánico, el estrés mecánico tiene un profundo impacto en la integridad de la matriz extracelular y probablemente causa la inducción de una serie de genes de la matriz extracelular para la reparación y remodelación de la matriz extracelular en el estroma tisular y las membranas basales. Un estudio examinó los efectos in vitro de la presión en la transcripción génica global utilizando un enfoque de microarray y un sistema de estiramiento celular destinado a simular la presión intraocular en la lámina cribosa (tejido conectivo) de la cabeza del nervio óptico. Sus hallazgos fueron que el perlecano y varios otros proteoglicanos se regulaban positivamente en respuesta al estímulo de estiramiento. También se indujeron TGF-β2 y VEGF, posiblemente contribuyendo a la regulación positiva de la transcripción y la proteína de perlecano. [73] Se ha demostrado que la señalización autocrina de TGF-β es un resultado compensatorio del estrés mecánico in vitro en células endoteliales. Utilizando un mecanismo de estiramiento celular similar para imitar la presión arterial, esta investigación mostró que la producción de perlecano aumentó en respuesta a la tensión mecánica. Esto depende de la señalización autocrina de TGF-β en un ciclo de retroalimentación positiva con p38 y ERK. [74] Este aumento de la producción de inhibidores del crecimiento de VSMC (es decir, heparina) en las células endoteliales se revierte en las VSMC, donde el estrés mecánico induce la proliferación. [75] La deformación de las células VSMC en cultivo conduce a la regulación positiva de perlecano, con un aumento significativo en la sulfatación de las cadenas de heparán sulfato. [76] Esto no contrasta con los datos mostrados donde la expresión de perlecano es constante más allá de e19 en VSMC de rata, lo que sugirió que perlecano juega un papel antiproliferativo para las VSMC. En este caso, parece que la función de señalización de la molécula es el factor operativo regulado positivamente, especialmente debido al aumento en la sulfatación de las cadenas de heparán sulfato.
El daño químico a los órganos puede afectar no sólo la integridad genética y mecánica de la célula, sino también la matriz extracelular del tejido. Para estudiar el efecto del daño químico en las células hepáticas, se trató a ratas Wistar con tetracloruro de carbono durante 48 horas antes del sacrificio. Antes del tratamiento con CCl4 , la tinción de perlecan se limitaba al conducto biliar y los vasos sanguíneos sinusoidales del hígado. Después del tratamiento, la tinción de perlecan fue intensa en las áreas de necrosis. Esto podría haberse debido al aumento de la capilarización del hígado como un intento de regenerar el tejido dañado. [77] Un hallazgo similar se mostró en el tratamiento con acetaminofén de ratones, donde el perlecan y otros componentes de la matriz se expresaron en gran medida en las lesiones necróticas del hígado. [78]
Uno de los argumentos más contundentes contra la validez de los resultados in vitro de cultivos celulares en placas de plástico 2D es que el entorno no refleja con precisión el de las células del organismo. Este problema se está abordando mediante el desarrollo de cultivos celulares 3D que utilizan una amplia variedad de sustratos como andamios o entornos para las células. En este tipo de entorno, la expresión de los genes de la matriz extracelular tiene el potencial de parecerse más a la del perfil de expresión nativo. Los andamios 3D, las estructuras sobre las que crecen las células cultivadas, pueden estar compuestos por otras células, es decir, cocultivos, polímeros sintéticos que imitan el entorno natural de las células o matriz extracelular purificada como el matrigel, y cualquier mezcla de estos tres componentes.
Se ha desarrollado un sistema de este tipo para estudiar el desarrollo de la piel y la formación de la membrana basal entre los queratinocitos y el estroma. [79] Este sistema se utiliza para delinear el desarrollo de la membrana basal entre los fibroblastos en el estroma (en este caso, fibroblastos en un gel de colágeno tipo I) y los queratinocitos cultivados sobre el gel. La expresión de perlecano y, por lo tanto, la maduración de la membrana basal dependen de la reticulación del colágeno IV y la cadena γ1 de laminina por nidógeno en este sistema. [80] Este efecto también provocó una falta de hemidesmosomas en el tejido en desarrollo. Se ha utilizado otro sistema que utiliza un gel de colágeno I hidratado desorganizado para demostrar que los fibroblastos corneales humanos primarios invadirán finalmente el gel y crearán una matriz que consta de colágeno tipo I y perlecano, así como varias otras glicoproteínas de matriz sulfatadas. Esto imita el programa de desarrollo de los fibroblastos corneales in vivo y la respuesta a las lesiones. [81]
Uno de los objetivos a largo plazo de la creación de sistemas de cultivo celular en 3D es diseñar tejidos que puedan utilizarse como reemplazos para pacientes con muchos tipos de enfermedades. En válvulas cardíacas diseñadas mediante ingeniería tisular creadas mediante la siembra de miofibroblastos en colágeno tipo I seguido de células endoteliales, se ha verificado la expresión del proteoglicano de heparán sulfato, aunque no se ha hecho distinción entre sindecano y perlecano en estos tejidos. [82] Otro procedimiento que podría ser posible gracias a la ingeniería tisular es la queratoepitelioplastia. El tejido trasplantado debe permanecer intacto, lo que requiere una membrana basal preformada. Los geles de colágeno han promovido la formación de una membrana basal completa por parte de las células epiteliales corneales en cultivo. [83]
El perlecano también es prometedor como armazón para sembrar células en cultivo. Se han cultivado con éxito células acinares y ductales de las glándulas salivales humanas en un péptido bioactivo que contiene una secuencia repetida en el dominio IV de la proteína perlecano. Estas células reproducen estructuras similares a los acinos, similares a las que se encuentran en la glándula nativa y las uniones estrechas, junto con membranas basales completas en cultivo. [84]
Mientras que la supresión de perlecan causa una inhibición sustancial del crecimiento tumoral y la neovascularización en ratones nulos, por el contrario, cuando se inyectan células nulas de perlecan en ratones desnudos se observa un mayor crecimiento tumoral en comparación con los controles. La progresión y patogénesis del cáncer están íntimamente relacionadas con la composición de la matriz extracelular y el papel del perlecan y otras moléculas de la matriz extracelular en el cáncer está siendo estudiado por un gran número de laboratorios. Dado que la membrana basal es el primer obstáculo en el camino de las células de carcinoma extravasantes, las funciones del perlecan en este proceso son múltiples. Un sistema modelo utilizado para estudiar la expresión de perlecan en líneas celulares de carcinoma es el de las líneas celulares de progresión metastásica de melanoma MeWo/70W. Las células MeWo son característicamente menos invasivas que su línea celular variante clonal 70W. Un laboratorio estudió la expresión de perlecan en 27 melanomas invasivos y 26 de las 27 muestras mostraron un aumento significativo en el mensaje de perlecan en comparación con el tejido normal de los mismos pacientes. Luego utilizaron las líneas celulares MeWo y 70W para estudiar si la expresión de perlecan cambiaba durante el tratamiento con neurotrofinas, que pueden estimular la invasión celular a través de Matrigel in vitro. Las células 70W más invasivas comenzaron a expresar el mensaje de perlecan diez minutos después de la estimulación con las neurotrofinas, y las células MeWo no produjeron ningún mensaje de pln independientemente del tratamiento. Este estudio tomó nota especial del hecho de que la regulación positiva de perlecan ocurrió incluso antes que la de la heparanasa, una proteína esencial involucrada en el proceso de extravasación. [85] [86]
En el cáncer de ovario, al igual que en otros tipos de cáncer, la expresión de perlecan se produce de forma diferente a lo largo de la progresión de la enfermedad. La tinción de perlecan se pierde en la membrana basal del ovario que ha sido perforada por un adenocarcinoma invasivo, lo que contrasta con la tinción de perlecan en las membranas basales de los ovarios normales y aquellos con tumores benignos, donde la membrana basal es homogénea y muy similar en composición a la de otros tejidos normales. [87] Esto es coherente con otros resultados que muestran la pérdida de perlecan en las membranas basales afectadas por el cáncer cervical invasivo que se extiende a los ganglios linfáticos pélvicos, lo que no sorprende debido a la correlación de los niveles elevados de expresión de ARNm de heparanasa con la invasión de carcinoma cervical similar. [88] Por el contrario, la formación de tumores de la línea celular epitelial de ratón inmortalizada RT101 inyectada en ratas dependía de la expresión de perlecan por las células del ratón y no de la presencia de perlecan endógeno de rata. Las células RT101 con perlecan inactivado por antisentido no mostraron formación de tumores en este sistema, sin embargo, las células que expresaban el perlecan antisentido y un constructo recombinante que codificaba los dominios I, II y III del perlecan de ratón sí mostraron formación de tumores. Por lo tanto, en este sistema parece que la expresión de perlecan en células tumorales es necesaria para la agregación tumoral. [89] Más investigaciones sobre la modificación de la cadena GAG o de la proteína central por células tumorales invasivas en comparación con las células tumorales benignas y el tejido normal serían informativas para comprender mejor el papel de los perlecan en la migración del cáncer.
Varios laboratorios han estudiado la angiogénesis de células tumorales in vitro utilizando construcciones antisentido para el mensaje de perlecan. El ADNc del complemento inverso de longitud completa, impulsado por un promotor fuerte, se transfecta en varios tipos de células para eliminar la expresión de perlecan. El antisentido en células de carcinoma de colon bloquea la traducción de perlecan, lo que conduce a una disminución del crecimiento tumoral y la angiogénesis. [90] Una disminución similar in vitro en la proliferación ocurrió en células NIH 3T3 y una línea celular de melanoma humano que expresaba ARNm de perlecan antisentido. [91] Los hallazgos in vitro con líneas celulares de sarcoma de Kaposi mostraron que la pérdida de perlecan a través de la transfección con una construcción antisentido condujo a una disminución de la proliferación y migración de este tipo de célula altamente metastásica. [92] Estos resultados contrastan con los resultados in vivo con las mismas líneas de sarcoma de Kaposi, que muestran que la disminución de perlecan conduce a un aumento de la angiogénesis, lo que facilita la migración y, por lo tanto, se asocia con un aumento en el grado del tumor. [92] La supresión de perlecan en líneas celulares de fibrosarcoma condujo a un mayor crecimiento y migración tanto in vitro como in vivo. [93] Estos hallazgos de mayor tumorogénesis in vivo están respaldados por datos que muestran que el extremo C de la proteína perlecan actúa como un módulo endostático ahora conocido como endorepelina. [46] [47] [94]
Se creó un constructo de ribozima para su uso en la reducción de los niveles de traducción de perlecan. Esta ribozima se dirigió a un dominio de codificación de secuencia I de la proteína perlecan. Redujo la expresión de perlecan hasta un 80% en la línea celular de cáncer de próstata C42B. [95] En contraste con estudios discutidos previamente, estas células produjeron tumores más pequeños que sus células parentales cuando se inyectaron en ratones atímicos. Se desconoce qué significa esta disparidad en los resultados para la invasión, aunque es cierto que el perlecan es parte de la matriz extracelular en el tejido mesenquimal, y las células que experimentan la transición epitelial-mesenquimal (EMT) pueden regular positivamente la expresión de perlecan como parte de su programación de EMT.
Los niveles de perlecano disminuyen en muchas enfermedades, como diabetes , aterosclerosis y artritis . El perlecano tiene un papel importante en el mantenimiento de la barrera de filtración glomerular. [96] La disminución del perlecano en la membrana basal glomerular tiene un papel central en el desarrollo de albuminuria diabética. La expresión de perlecano se regula a la baja por muchos estímulos aterogénicos y, por lo tanto, se cree que el perlecano desempeña un papel protector en la aterosclerosis. [97] [98] La diabetes y la aterosclerosis son síndromes comúnmente asociados. El 80% de las muertes asociadas con la diabetes implican alguna forma de complicación aterosclerótica, y la membrana basal de los endotelios se ha implicado en el proceso aterogénico. Se ha demostrado que la síntesis de heparán sulfato disminuye en las arterias de los diabéticos y en las arterias que desarrollan lesiones ateroscleróticas. [99]
El mecanismo por el cual el sulfato de heparán se regulaba a la baja en estas lesiones permaneció desconocido durante algún tiempo. Una teoría afirma que la alta glucosa en circulación podría conducir a una disminución en la unión de la cadena GAG al perlecano, pero no necesariamente a un cambio en la vía sintética de las cadenas GAG o la de la proteína central. Después del tratamiento de células endoteliales aórticas humanas con un medio con alto contenido de glucosa, el perlecano secretado contenía menos incorporación de sulfato acompañada de una menor incorporación general de la cadena GAG. [100] Aunque no se identifica ninguna vía de señalización que conduzca a esta disminución en la incorporación de la cadena GAG, se sugiere que la pérdida del 30% en la glicosilación general de la proteína podría significar la pérdida de una de las tres cadenas HS en el perlecano en este modelo de hiperglucemia asociada a la diabetes. También se observa que se producen disminuciones similares en HS extracelular sin un cambio en la tinción de las cadenas de proteína central en riñones diabéticos y en células renales en cultivo tratadas con alto contenido de glucosa. [101] [102]
La aterosclerosis es la causa más frecuente de la enfermedad coronaria y otras enfermedades cardiovasculares, y una gran acumulación de proteína perlecan es sintomática de placas ateroscleróticas avanzadas. Las VSMC son las productoras de perlecan en esta afección, lo que significa que una gran parte de la investigación se ha centrado en comprender los medios de regulación positiva de perlecan en esta afección. En una prueba del efecto de los ácidos grasos no esterificados circulantes (sintomáticos de diabetes y aterogénesis) en la expresión de perlecan por VSMC, la expresión no cambió en comparación con las células de control. Esto contrastaba con un aumento de 2 a 10 veces en la expresión de otros proteoglicanos de la membrana basal. [103] La trombina es otro marcador asociado con la aterogénesis y la procoagulación, y regula positivamente de forma selectiva la producción de perlecan pero no de otros proteoglicanos en VSMC humanas en cultivo. [104] Se sugiere que este efecto solo se observa cuando las VSMC alcanzan la confluencia, pero no antes de la confluencia. Este concepto es similar a estudios mencionados anteriormente que muestran que el perlecano solo es producido por las VSMC una vez que han cesado la proliferación durante el desarrollo. [35] [36] Otro marcador en la vía aterosclerótica es la angiotensina II, que también regula positivamente la expresión de perlecano en las VSMC en cultivo. [105] Dada la prominencia de la expresión de perlecano en la aterosclerosis, existe potencial para una terapia basada en la expresión de perlecano y la investigación puede eventualmente avanzar en esa dirección.
Las mutaciones en el gen HSPG2 , que codifica el perlecano, causan displasia disegmentaria, [6] tipo Silverman-Handmaker y síndrome de Schwartz-Jampel . [9]
Se ha demostrado que el perlecán interactúa con
{{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo a partir de septiembre de 2024 ( enlace )