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El inmunoensayo de polarización de fluorescencia ( FPIA ) es una clase de prueba bioquímica in vitro utilizada para la detección rápida de anticuerpos o antígenos en una muestra. FPIA es un ensayo homogéneo competitivo , que consiste en un método simple de preparación y lectura, sin el requisito de pasos de separación o lavado.
La base del ensayo es la anisotropía de fluorescencia , también conocida como polarización de fluorescencia. Si una molécula fluorescente está estacionaria y expuesta a luz polarizada en un plano , se excitará y, en consecuencia, emitirá radiación de regreso al plano polarizado. Sin embargo, si la molécula fluorescente excitada está en movimiento (rotación o traslación) durante la vida útil de la fluorescencia, emitirá luz en una dirección diferente a la del plano de excitación. La vida útil de la fluorescencia es la cantidad de tiempo entre el momento de absorción y el momento de emisión de la fluorescencia.
Por lo general, la velocidad a la que gira una molécula es indicativa de su tamaño. [1] Cuando una molécula marcada con fluorescencia (trazador) se une a otra molécula, el movimiento de rotación cambiará, lo que dará como resultado una intensidad alterada de la luz polarizada en el plano, lo que da como resultado una polarización de la fluorescencia alterada. [2] Los inmunoensayos de polarización de fluorescencia emplean un antígeno unido a un fluoróforo que, cuando se une al anticuerpo de interés, aumentará la polarización de la fluorescencia. El cambio en la polarización es proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra y se mide mediante un analizador de polarización de fluorescencia. [3]
La polarización de la fluorescencia fue observada por primera vez por F. Weigert en 1920. Experimentó con soluciones de fluoresceína, eosina y otros colorantes a distintas temperaturas y viscosidades. Al observar que la polarización aumentaba con la viscosidad del disolvente y el tamaño de la molécula del colorante, pero disminuía con el aumento de la temperatura, dedujo que la polarización aumentaba con la disminución de la movilidad de las especies emisoras. [2] Entre 1925 y 1926, Francis Perrin detalló una teoría cuantitativa de la polarización de la fluorescencia en múltiples publicaciones importantes que siguen siendo relevantes hasta el día de hoy. [2]
Desde la contribución de Perrin, la técnica ha evolucionado desde la determinación de isotermas de unión bajo parámetros muy controlados hasta el estudio de interacciones de unión antígeno - anticuerpo , molécula pequeña - proteína y hormona - receptor . [4] Un inmunoensayo de polarización de fluorescencia se describió y utilizó por primera vez en la década de 1960. [5] [6] La característica homogénea competitiva permitió que el inmunoensayo de polarización de fluorescencia se automatizara mucho más fácilmente que otras técnicas de inmunoensayo como los radioinmunoensayos o los inmunoensayos ligados a enzimas . [4]
A pesar de haberse originado como un método para estudios de interacción directa, la técnica ha sido adoptada por el cribado de alto rendimiento (HTS) desde mediados de la década de 1990 para ayudar a facilitar el proceso de descubrimiento de fármacos mediante el estudio de interacciones enzimáticas complejas . [4]
La FPIA cuantifica el cambio en la polarización de fluorescencia de mezclas de reacción de trazador marcado con fluorescencia, antígeno de muestra y anticuerpo definido . Operar bajo temperatura y viscosidad fijas permite que la polarización de fluorescencia sea directamente proporcional al tamaño del fluoróforo. El trazador libre en solución tiene una polarización de fluorescencia menor que el trazador unido al anticuerpo con un movimiento browniano más lento. El trazador y el antígeno específico competirán para unirse al anticuerpo y si el antígeno está en baja concentración, más trazador se unirá al anticuerpo, lo que dará como resultado una mayor polarización de fluorescencia y viceversa. [7]
Una FPIA convencional sigue el procedimiento que se indica a continuación:
La FPIA ha surgido como una técnica viable para la cuantificación de pequeñas moléculas en mezclas, incluyendo: pesticidas , [8] micotoxinas [9] en alimentos, compuestos farmacéuticos en aguas residuales, [10] metabolitos en orina y suero indicativos del uso de drogas ( cannabinoides , anfetaminas , barbitúricos , cocaína , benzodiazepinas , metadona , opiáceos y PCP ), [11] [12] y varias toxinas de moléculas pequeñas . Así como con el análisis de interacciones hormona - receptor . [4]