El cribado de alto contenido (HCS), también conocido como análisis de alto contenido (HCA) o celómica , es un método que se utiliza en la investigación biológica y el descubrimiento de fármacos para identificar sustancias como moléculas pequeñas , péptidos o ARNi que alteran el fenotipo de una célula de la manera deseada. [1] [2] Por lo tanto, el cribado de alto contenido es un tipo de cribado fenotípico realizado en células que implica el análisis de células completas o componentes de células con lectura simultánea de varios parámetros. [3] El HCS está relacionado con el cribado de alto rendimiento (HTS), en el que se prueban miles de compuestos en paralelo para determinar su actividad en uno o más ensayos biológicos, pero implica ensayos de fenotipos celulares más complejos como resultados. [4] Los cambios fenotípicos pueden incluir aumentos o disminuciones en la producción de productos celulares como proteínas y/o cambios en la morfología (apariencia visual) de la célula. Por lo tanto, el HCA generalmente implica microscopía automatizada y análisis de imágenes. [4] A diferencia del análisis de alto contenido, la detección de alto contenido implica un nivel de rendimiento, por lo que el término "detección" diferencia el HCS del HCA, que puede tener un alto contenido pero un bajo rendimiento.
En el cribado de alto contenido, primero se incuban las células con la sustancia y después de un período de tiempo, se analizan las estructuras y los componentes moleculares de las células. El análisis más común implica el etiquetado de proteínas con etiquetas fluorescentes y, finalmente, se miden los cambios en el fenotipo celular utilizando un análisis de imágenes automatizado . Mediante el uso de etiquetas fluorescentes con diferentes máximos de absorción y emisión, es posible medir varios componentes celulares diferentes en paralelo. Además, la obtención de imágenes puede detectar cambios a nivel subcelular (p. ej., citoplasma frente a núcleo frente a otros orgánulos ). Por lo tanto, se puede recopilar una gran cantidad de puntos de datos por célula. Además del etiquetado fluorescente, se han utilizado varios ensayos sin etiquetas en el cribado de alto contenido. [5]
El cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados en células utiliza células vivas como herramientas en la investigación biológica para dilucidar el funcionamiento de las células normales y enfermas. El HCS también se utiliza para descubrir y optimizar nuevos candidatos a fármacos. El cribado de alto contenido es una combinación de la biología celular moderna , con todas sus herramientas moleculares, con microscopía automatizada de alta resolución y manipulación robótica. Las células se exponen primero a productos químicos o reactivos de ARNi . Luego, se detectan los cambios en la morfología celular mediante análisis de imágenes . Los cambios en las cantidades de proteínas sintetizadas por las células se miden utilizando una variedad de técnicas, como las proteínas fluorescentes verdes fusionadas a proteínas endógenas o mediante anticuerpos fluorescentes .
La tecnología puede utilizarse para determinar si un fármaco potencial modifica la enfermedad. Por ejemplo, en los seres humanos, los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) son una gran familia de alrededor de 880 proteínas de la superficie celular que transducen cambios extracelulares en el entorno en una respuesta celular, como desencadenar un aumento de la presión arterial debido a la liberación de una hormona reguladora en el torrente sanguíneo. La activación de estos GPCR puede implicar su entrada en las células y, cuando esto se puede visualizar, puede ser la base de un análisis sistemático de la función del receptor a través de la genética química , el cribado sistemático del genoma completo o la manipulación fisiológica.
A nivel celular, la adquisición paralela de datos sobre diferentes propiedades celulares, por ejemplo, la actividad de las cascadas de transducción de señales y la integridad del citoesqueleto, es la principal ventaja de este método en comparación con el cribado de alto rendimiento , que es más rápido pero menos detallado . Si bien el cribado de alto rendimiento es más lento, la riqueza de los datos adquiridos permite una comprensión más profunda de los efectos de los fármacos.
El cribado automatizado basado en imágenes permite la identificación de compuestos pequeños que alteran los fenotipos celulares y es de interés para el descubrimiento de nuevos fármacos y nuevas herramientas biológicas celulares para modificar la función celular. La selección de moléculas en función de un fenotipo celular no requiere un conocimiento previo de los objetivos bioquímicos que se ven afectados por los compuestos. Sin embargo, la identificación del objetivo biológico facilitará considerablemente la optimización preclínica y el desarrollo clínico posteriores del compuesto afectado. Dado el aumento en el uso del cribado fenotípico/visual como herramienta biológica celular, se requieren métodos que permitan la identificación sistemática de objetivos bioquímicos si se pretende que estas moléculas sean de uso generalizado. [6] La identificación de objetivos se ha definido como el paso limitante de la velocidad en el cribado de alto contenido/genética química. [7]
La tecnología de cribado de alto contenido se basa principalmente en la microscopía digital automatizada y la citometría de flujo , en combinación con sistemas de TI para el análisis y almacenamiento de los datos. La tecnología de “alto contenido” o biología visual tiene dos propósitos, primero, adquirir información resuelta espacial o temporalmente sobre un evento y segundo, cuantificarla automáticamente. Los instrumentos con resolución espacial suelen ser microscopios automatizados , y la resolución temporal aún requiere alguna forma de medición de fluorescencia en la mayoría de los casos. Esto significa que muchos instrumentos HCS son microscopios ( de fluorescencia ) que están conectados a algún tipo de paquete de análisis de imágenes. Estos se encargan de todos los pasos para tomar imágenes fluorescentes de células y brindan una evaluación rápida, automatizada e imparcial de los experimentos.
Los instrumentos HCS que se comercializan actualmente se pueden separar en función de una serie de especificaciones que influyen significativamente en la versatilidad de los instrumentos y en el coste total. Entre ellas se incluyen la velocidad, una cámara de células vivas que incluye control de temperatura y CO2 ( algunos también tienen control de humedad para la obtención de imágenes de células vivas a largo plazo), una pipeta o inyector integrado para ensayos cinéticos rápidos y modos de obtención de imágenes adicionales, como confocal, campo claro, contraste de fase y FRET. Una de las diferencias más incisivas es si los instrumentos son confocales ópticos o no. La microscopía confocal se resume en la obtención de imágenes/resolución de un corte fino a través de un objeto y el rechazo de la luz desenfocada que proviene del exterior de este corte. La obtención de imágenes confocales permite una mayor relación señal-ruido de la imagen y una mayor resolución que la microscopía de epifluorescencia que se aplica con más frecuencia . Según el instrumento, la confocalidad se consigue mediante un escaneo láser, un solo disco giratorio con orificios o ranuras, un disco giratorio doble o una ranura virtual. Existen compensaciones en términos de sensibilidad, resolución, velocidad, fototoxicidad, fotoblanqueo, complejidad del instrumento y precio entre estas diversas técnicas confocales.
Lo que todos los instrumentos comparten es la capacidad de tomar, almacenar e interpretar imágenes automáticamente e integrarlas en grandes plataformas robóticas de manipulación de células y medios.
Muchas pantallas se analizan utilizando el software de análisis de imágenes que acompaña al instrumento, lo que proporciona una solución integral. A menudo se utilizan alternativas de software de terceros para pantallas especialmente complejas o cuando un laboratorio o una instalación tiene varios instrumentos y desea estandarizarlos en una única plataforma de análisis. Sin embargo, algunos programas de instrumentos permiten la importación y exportación masiva de imágenes y datos para los usuarios que desean realizar dicha estandarización en una única plataforma de análisis sin el uso de software de terceros.
Esta tecnología permite realizar una cantidad (muy) grande de experimentos, lo que permite realizar un cribado exploratorio. Los sistemas basados en células se utilizan principalmente en genética química, donde se prueban sistemáticamente colecciones grandes y diversas de moléculas pequeñas para determinar su efecto en sistemas de modelos celulares. Se pueden encontrar nuevos fármacos utilizando cribado de decenas de miles de moléculas, y estos son prometedores para el futuro del desarrollo de fármacos. Más allá del descubrimiento de fármacos, la genética química tiene como objetivo funcionalizar el genoma mediante la identificación de pequeñas moléculas que actúan sobre la mayoría de los 21.000 productos genéticos de una célula. La tecnología de alto contenido formará parte de este esfuerzo, que podría proporcionar herramientas útiles para aprender dónde y cuándo actúan las proteínas eliminándolas químicamente. Esto sería más útil para los genes en los que no se puede producir un gen en ratones knock out (a los que les falta uno o varios genes) porque la proteína es necesaria para el desarrollo, el crecimiento o, de otro modo, es letal cuando no está presente. La eliminación química podría abordar cómo y dónde funcionan estos genes. Además, la tecnología se utiliza en combinación con el ARNi para identificar conjuntos de genes implicados en mecanismos específicos, por ejemplo, la división celular. En este caso, las bibliotecas de ARN que abarcan un conjunto completo de genes predichos dentro del genoma del organismo objetivo se pueden utilizar para identificar subconjuntos relevantes, lo que facilita la anotación de genes para los que no se ha establecido de antemano una función clara. Los grandes conjuntos de datos producidos por la biología celular automatizada contienen datos cuantitativos con resolución espacial que se pueden utilizar para construir modelos y simulaciones a nivel de sistemas de cómo funcionan las células y los organismos. Los modelos de biología de sistemas de la función celular permitirían predecir por qué, dónde y cómo responde la célula a los cambios externos, el crecimiento y la enfermedad.
La tecnología de detección de alto contenido permite la evaluación de múltiples parámetros bioquímicos y morfológicos en sistemas biológicos intactos.
Para los enfoques basados en células, la utilidad de la biología celular automatizada requiere un examen de cómo la automatización y la medición objetiva pueden mejorar la experimentación y la comprensión de las enfermedades. En primer lugar, elimina la influencia del investigador en la mayoría de los aspectos de la investigación en biología celular, pero no en todos, y, en segundo lugar, hace posibles enfoques completamente nuevos.
En resumen, la biología celular clásica del siglo XX utilizaba líneas celulares cultivadas en cultivos en los que se medían los experimentos utilizando métodos muy similares a los que se describen aquí, pero en ese caso el investigador era quien decidía qué se medía y cómo. A principios de los años 90, el desarrollo de cámaras con dispositivo acoplado a carga (CCD) para la investigación creó la oportunidad de medir características en imágenes de células, como cuánta proteína hay en el núcleo y cuánta hay fuera. Pronto se realizaron mediciones sofisticadas utilizando nuevas moléculas fluorescentes, que se utilizan para medir propiedades celulares como las concentraciones de segundos mensajeros o el pH de los compartimentos celulares internos. El uso generalizado de la proteína verde fluorescente, una molécula de proteína fluorescente natural de las medusas, aceleró la tendencia hacia la obtención de imágenes celulares como una tecnología convencional en biología celular. A pesar de estos avances, la elección de qué célula obtener imágenes y qué datos presentar y cómo analizarlos seguía siendo seleccionada por el investigador.
Por analogía, si uno imagina un campo de fútbol y platos de comida colocados sobre él, en lugar de mirarlos todos, el investigador elegiría un puñado cerca de la línea de puntuación y tendría que dejar el resto. En esta analogía, el campo es una placa de cultivo de tejidos, las placas, las células que crecen en él. Si bien este fue un enfoque razonable y pragmático, la automatización de todo el proceso y el análisis hacen posible el análisis de toda la población de células vivas, por lo que se puede medir todo el campo de fútbol.