Un microscopio de rayos X utiliza radiación electromagnética en la banda de rayos X para producir imágenes ampliadas de los objetos. Dado que los rayos X penetran en la mayoría de los objetos, no es necesario prepararlos especialmente para las observaciones con microscopio de rayos X.
A diferencia de la luz visible , los rayos X no se reflejan ni se refractan fácilmente y son invisibles para el ojo humano. Por lo tanto, un microscopio de rayos X expone una película o utiliza un detector de dispositivo acoplado a carga (CCD) para detectar los rayos X que pasan a través de la muestra. Es una tecnología de imágenes de contraste que utiliza la diferencia en la absorción de rayos X blandos en la región de la ventana de agua (longitudes de onda: 2,34–4,4 nm, energías: 280–530 eV) por el átomo de carbono (elemento principal que compone la célula viva) y el átomo de oxígeno (un elemento del agua).
Los rayos X con microfoco también consiguen un gran aumento mediante proyección. Un tubo de rayos X con microfoco produce rayos X desde un punto focal extremadamente pequeño (de 5 μm a 0,1 μm). Los rayos X se encuentran en el rango de rayos X más convencional (de 20 a 300 keV) y no se reenfocan.
La historia de la microscopía de rayos X se remonta a principios del siglo XX. Después de que el físico alemán Röntgen descubriera los rayos X en 1895, los científicos pronto iluminaron un objeto utilizando una fuente puntual de rayos X y capturaron las imágenes de sombra del objeto con una resolución de varios micrómetros. [2] En 1918, Einstein señaló que el índice de refracción de los rayos X en la mayoría de los medios debería ser apenas un poco mayor que 1, [3] lo que significa que las piezas ópticas refractivas serían difíciles de usar para aplicaciones de rayos X.
Los primeros microscopios de rayos X de Paul Kirkpatrick y Albert Baez utilizaban una óptica de rayos X reflectante de incidencia rasante para enfocar los rayos X, que los hacían rozar en espejos curvos parabólicos con un ángulo de incidencia muy alto . Un método alternativo para enfocar los rayos X es utilizar una pequeña placa de zona de Fresnel de anillos concéntricos de oro o níquel sobre un sustrato de dióxido de silicio . Sir Lawrence Bragg produjo algunas de las primeras imágenes de rayos X utilizables con su aparato a finales de la década de 1940.
En la década de 1950, Sterling Newberry produjo un microscopio de rayos X de sombra, que colocaba la muestra entre la fuente y una placa objetivo; esto se convirtió en la base de los primeros microscopios de rayos X comerciales de la General Electric Company .
Después de un período de silencio en la década de 1960, la microscopía de rayos X recuperó la atención de la gente en la década de 1970. En 1972, Horowitz y Howell construyeron el primer microscopio de rayos X basado en sincrotrón en el Acelerador de Electrones de Cambridge. [4] Este microscopio escaneó muestras utilizando radiación de sincrotrón desde un pequeño orificio y mostró las capacidades tanto de la microscopía de transmisión como de la de fluorescencia. Otros desarrollos en este período incluyen la primera demostración holográfica de Sadao Aoki y Seishi Kikuta en Japón, [5] los primeros TXM que utilizan placas de zona de Schmahl et al., [6] y los experimentos de Stony Brook en STXM . [7] [8]
En la década de 1980, el uso de fuentes de luz de sincrotrón trajo consigo nuevas posibilidades para la microscopía de rayos X. Sin embargo, a medida que se construían nuevos microscopios basados en fuentes de sincrotrón en muchos grupos, la gente se dio cuenta de que era difícil realizar tales experimentos debido a las capacidades tecnológicas insuficientes en ese momento, como iluminaciones coherentes deficientes, elementos ópticos de rayos X de mala calidad y fuentes de luz poco fáciles de usar. [9]
A principios de los años 1990, nuevos instrumentos y nuevas fuentes de luz impulsaron en gran medida la mejora de la microscopía de rayos X. Se demostraron con éxito métodos de microscopía que incluían tomografía, crio- y crio-tomografía. Con un desarrollo rápido, la microscopía de rayos X encontró nuevas aplicaciones en la ciencia del suelo, la geoquímica, las ciencias de los polímeros y el magnetismo. El hardware también se miniaturizó, de modo que los investigadores pudieran realizar experimentos en sus propios laboratorios. [9]
Se pueden obtener fuentes de rayos X de intensidad extremadamente alta de 9,25 keV para microscopía de contraste de fases de rayos X, desde un punto focal de aproximadamente 10 μm × 10 μm, con una fuente de rayos X no sincrotrón que utiliza un haz de electrones enfocado y un ánodo de metal líquido. Esto se demostró en 2003 y en 2017 se utilizó para obtener imágenes del cerebro de un ratón con un tamaño de vóxel de aproximadamente un micrómetro cúbico (ver a continuación). [10]
Con el continuo crecimiento de sus aplicaciones, la microscopía de rayos X se ha convertido en una técnica rutinaria y probada que se utiliza en ciencias ambientales y del suelo, geoquímica y cosmoquímica, ciencias de polímeros, biología, magnetismo y ciencias de los materiales. Con esta creciente demanda de microscopía de rayos X en estos campos, se están construyendo microscopios basados en sincrotrón, ánodo de metal líquido y otras fuentes de luz de laboratorio en todo el mundo. La óptica y los componentes de rayos X también se están comercializando rápidamente. [9]
El Advanced Light Source (ALS) en Berkeley, California, es el hogar de XM-1, un microscopio de rayos X blandos de campo completo operado por el Centro de Óptica de Rayos X y dedicado a varias aplicaciones en nanociencia moderna, como materiales nanomagnéticos, ciencias ambientales y de materiales y biología. XM-1 utiliza una lente de rayos X para enfocar los rayos X en un CCD, de manera similar a un microscopio óptico. XM-1 mantuvo el récord mundial en resolución espacial con placas de zona de Fresnel de hasta 15 nm y es capaz de combinar una alta resolución espacial con una resolución temporal inferior a 100 ps para estudiar, por ejemplo, dinámicas de espín ultrarrápidas. En julio de 2012, un grupo de DESY afirmó una resolución espacial récord de 10 nm, utilizando el microscopio de barrido de rayos X duros en PETRA III . [11]
El ALS también alberga el primer microscopio de rayos X blandos del mundo diseñado para la investigación biológica y biomédica. Este nuevo instrumento, el XM-2, fue diseñado y construido por científicos del Centro Nacional de Tomografía de Rayos X. El XM-2 es capaz de producir tomografías tridimensionales de células.
Se pueden obtener fuentes de rayos X de intensidad extremadamente alta de 9,25 keV (línea K-alfa de galio) para microscopía de contraste de fases de rayos X, desde un punto focal de aproximadamente 10 um x 10 um, con una fuente de rayos X que utiliza un ánodo de galinstan de metal líquido . Esto se demostró en 2003. [10] El metal fluye desde una boquilla hacia abajo a alta velocidad y la fuente de electrones de alta intensidad se enfoca sobre él. El flujo rápido de metal transporta corriente, pero el flujo físico evita una gran cantidad de calentamiento del ánodo (debido a la eliminación de calor por convección forzada), y el alto punto de ebullición del galinstan inhibe la vaporización del ánodo. La técnica se ha utilizado para obtener imágenes del cerebro de ratones en tres dimensiones con un tamaño de vóxel de aproximadamente un micrómetro cúbico. [12]
Las fuentes de rayos X suaves adecuadas para la microscopía, como las fuentes de radiación de sincrotrón , tienen un brillo bastante bajo de las longitudes de onda requeridas, por lo que un método alternativo de formación de imágenes es la microscopía de rayos X suaves de transmisión por barrido. Aquí los rayos X se enfocan en un punto y la muestra se escanea mecánicamente a través del punto focal producido. En cada punto, los rayos X transmitidos se registran utilizando un detector como un contador proporcional o un fotodiodo de avalancha . Este tipo de microscopio de rayos X de transmisión por barrido (STXM) fue desarrollado por primera vez por investigadores de la Universidad de Stony Brook y se empleó en la Fuente Nacional de Luz de Sincrotrón en el Laboratorio Nacional de Brookhaven .
La resolución de la microscopía de rayos X se encuentra entre la del microscopio óptico y la del microscopio electrónico . Tiene una ventaja sobre la microscopía electrónica convencional: puede ver muestras biológicas en su estado natural. La microscopía electrónica se usa ampliamente para obtener imágenes con una resolución de nivel nanométrico a sub-Angstrom, pero no se puede observar la célula viva relativamente gruesa, ya que la muestra debe fijarse químicamente, deshidratarse, incrustarse en resina y luego cortarse en rodajas ultrafinas. Sin embargo, debe mencionarse que la criomicroscopía electrónica permite la observación de muestras biológicas en su estado natural hidratado, aunque incrustadas en hielo de agua. Hasta ahora, se pueden lograr resoluciones de 30 nanómetros utilizando la lente de placa de zona de Fresnel que forma la imagen utilizando los rayos X suaves emitidos por un sincrotrón. Recientemente, se está volviendo más popular el uso de rayos X suaves emitidos por plasmas producidos por láser en lugar de radiación de sincrotrón.
Además, los rayos X causan fluorescencia en la mayoría de los materiales, y estas emisiones se pueden analizar para determinar los elementos químicos de un objeto en la imagen. Otro uso es generar patrones de difracción , un proceso utilizado en la cristalografía de rayos X. Al analizar las reflexiones internas de un patrón de difracción (normalmente con un programa informático), se puede determinar la estructura tridimensional de un cristal hasta la ubicación de los átomos individuales dentro de sus moléculas. A veces se utilizan microscopios de rayos X para estos análisis porque las muestras son demasiado pequeñas para analizarlas de otra forma.
Una de las primeras aplicaciones de la microscopía de rayos X en biología fue la obtención de imágenes por contacto, iniciada por Goby en 1913. En esta técnica, los rayos X suaves irradian una muestra y exponen las emulsiones sensibles a los rayos X que se encuentran debajo de ella. Luego, se registran imágenes tomográficas ampliadas de las emulsiones, que corresponden a los mapas de opacidad de rayos X de la muestra, utilizando un microscopio óptico o un microscopio electrónico. Una ventaja única que ofrecía la obtención de imágenes por contacto con rayos X sobre la microscopía electrónica era la capacidad de obtener imágenes de materiales biológicos húmedos. Por lo tanto, se utilizó para estudiar las estructuras a escala micro y nanométrica de plantas, insectos y células humanas. Sin embargo, varios factores, incluidas las distorsiones de la emulsión, las malas condiciones de iluminación y las bajas resoluciones de las formas de examinar las emulsiones, limitan la resolución de la obtención de imágenes por contacto. El daño electrónico de las emulsiones y los efectos de difracción también pueden dar lugar a artefactos en las imágenes finales. [13]
La microscopía de rayos X tiene ventajas únicas en términos de resolución a nanoescala y alta capacidad de penetración, ambas necesarias en estudios biológicos. Con el reciente progreso significativo en instrumentos y enfoque, las tres formas clásicas de óptica (difractiva [14] , reflectiva [15] [16], refractiva [17] ) se han expandido con éxito al rango de rayos X y se han utilizado para investigar las estructuras y dinámicas a escala celular y subcelular. En 2005, Shapiro et al. informaron sobre imágenes celulares de levaduras a una resolución de 30 nm utilizando microscopía de difracción de rayos X suaves coherentes. [18] En 2008, se demostró la obtención de imágenes de rayos X de un virus sin teñir. [19] Un año después, la difracción de rayos X se aplicó aún más para visualizar la estructura tridimensional de un cromosoma humano sin teñir. [20] La microscopía de rayos X ha demostrado así su gran capacidad para eludir el límite difractivo de los microscopios ópticos clásicos; Sin embargo, la mejora adicional de la resolución está limitada por los píxeles del detector, los instrumentos ópticos y los tamaños de las fuentes.
Una de las principales preocupaciones de larga data en el campo de la microscopía de rayos X es el daño por radiación, ya que los rayos X de alta energía producen radicales fuertes y desencadenan reacciones dañinas en muestras húmedas. Como resultado, las muestras biológicas suelen fijarse o liofilizarse antes de ser irradiadas con rayos X de alta potencia. Los tratamientos criogénicos rápidos también se utilizan comúnmente para preservar las estructuras hidratadas intactas. [21]
