Dispersión dinámica de la luz

Técnica para determinar la distribución de tamaño de partículas.

Dispersión de luz dinámica hipotética de dos muestras: partículas más grandes en la parte superior y partículas más pequeñas en la parte inferior

La dispersión dinámica de la luz ( DLS ) es una técnica en física que se puede utilizar para determinar el perfil de distribución de tamaño de partículas pequeñas en suspensión o polímeros en solución . ^[1] En el ámbito de DLS, las fluctuaciones temporales generalmente se analizan utilizando la función de intensidad o autocorrelación de fotones (también conocida como espectroscopia de correlación de fotones – PCS o dispersión de luz cuasi elástica – QELS ). En el análisis en el dominio del tiempo, la función de autocorrelación (ACF) generalmente decae a partir del tiempo de retardo cero, y una dinámica más rápida debido a partículas más pequeñas conduce a una descorrelación más rápida de la traza de intensidad dispersa. Se ha demostrado que la intensidad ACF es la transformada de Fourier del espectro de potencia y, por lo tanto, las mediciones DLS se pueden realizar igualmente bien en el dominio espectral. ^{[2] [3]} DLS también se puede utilizar para probar el comportamiento de fluidos complejos, como soluciones de polímeros concentradas.

Configuración

Se dispara una fuente de luz monocromática, generalmente un láser, a través de un polarizador hacia una muestra. Luego, la luz dispersada pasa a través de un segundo polarizador donde es recogida por un fotomultiplicador y la imagen resultante se proyecta en una pantalla. Esto se conoce como patrón moteado (Figura 1). ^[4]

Figura 1. Patrón moteado típico.

Todas las moléculas de la solución reciben la luz y todas las moléculas difractan la luz en todas direcciones. La luz difractada de todas las moléculas puede interferir de forma constructiva (regiones claras) o destructiva (regiones oscuras). Este proceso se repite en intervalos de tiempo cortos y el conjunto resultante de patrones de manchas se analiza mediante un autocorrelador que compara la intensidad de la luz en cada punto a lo largo del tiempo. Los polarizadores se pueden configurar en dos configuraciones geométricas. Una es una geometría vertical/vertical (VV), donde el segundo polarizador permite el paso de luz que está en la misma dirección que el polarizador primario. En geometría vertical/horizontal (VH), el segundo polarizador permite que la luz no esté en la misma dirección que la luz incidente.

Descripción

Cuando la luz incide en partículas pequeñas, la luz se dispersa en todas direcciones ( dispersión de Rayleigh ) siempre que las partículas sean pequeñas en comparación con la longitud de onda (por debajo de 250 nm ). Incluso si la fuente de luz es un láser y, por tanto, monocromática y coherente , la intensidad de dispersión fluctúa con el tiempo. Esta fluctuación se debe a que pequeñas partículas en suspensión experimentan un movimiento browniano , por lo que la distancia entre los dispersores en la solución cambia constantemente con el tiempo. Esta luz dispersada sufre entonces interferencias constructivas o destructivas por parte de las partículas circundantes, y dentro de esta fluctuación de intensidad se contiene información sobre la escala temporal del movimiento de los dispersores. La preparación de la muestra, ya sea mediante filtración o centrifugación, es fundamental para eliminar el polvo y los artefactos de la solución.

La información dinámica de las partículas se deriva de la autocorrelación de la traza de intensidad registrada durante el experimento. La curva de autocorrelación de segundo orden se genera a partir del trazo de intensidad de la siguiente manera:

${\displaystyle g^{2}(q;\tau )={\frac {\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t)\rangle ^{2}}}}$

donde g ² ( q ; τ ) es la función de autocorrelación en un vector de onda particular, q , y el tiempo de retardo, τ , e I es la intensidad. Los corchetes angulares indican el operador de valor esperado , que en algunos textos se indica con una E mayúscula . ${\displaystyle \langle \cdot \rangle }$

En retrasos de tiempo cortos, la correlación es alta porque las partículas no tienen la posibilidad de moverse en gran medida desde el estado inicial en el que se encontraban. Por lo tanto, las dos señales permanecen esencialmente sin cambios cuando se comparan después de un intervalo de tiempo muy corto. A medida que los retrasos se hacen más largos, la correlación decae exponencialmente, lo que significa que, después de que ha transcurrido un largo período, no hay correlación entre la intensidad dispersa de los estados inicial y final. Esta caída exponencial está relacionada con el movimiento de las partículas, específicamente con el coeficiente de difusión. Para ajustar la caída (es decir, la función de autocorrelación), se utilizan métodos numéricos, basados ​​en cálculos de distribuciones supuestas. Si la muestra es monodispersa (uniforme), entonces la caída es simplemente exponencial única. La ecuación de Siegert relaciona la función de autocorrelación de segundo orden con la función de autocorrelación de primer orden g ¹ ( q ; τ ) de la siguiente manera:

${\displaystyle g^{2}(q;\tau )=1+\beta \left[g^{1}(q;\tau )\right]^{2}}$

donde el primer término de la suma está relacionado con el valor de referencia (≈1) y el parámetro β es un factor de corrección que depende de la geometría y la alineación del rayo láser en la configuración de dispersión de luz. Es aproximadamente igual a la inversa del número de motas (consulte Patrón de motas ) de las que se recoge la luz. Un enfoque más pequeño del rayo láser produce un patrón de moteado más grueso, un número menor de moteado en el detector y, por lo tanto, una autocorrelación de segundo orden mayor. El uso más importante de la función de autocorrelación es su uso para la determinación del tamaño.

dispersión múltiple

La dispersión dinámica de la luz proporciona información sobre las propiedades dinámicas de los materiales blandos midiendo eventos de dispersión únicos, lo que significa que cada fotón detectado ha sido dispersado por la muestra exactamente una vez. En principio, las mediciones DLS se pueden realizar con el detector colocado en cualquier ángulo. La elección del mejor ángulo depende de las propiedades de la muestra, como la turbidez y el tamaño de las partículas. ^[5] La detección de retrodispersión (por ejemplo, 173° o 175°) es particularmente interesante para muestras turbias y altamente concentradas, que contienen partículas grandes. Se recomienda la detección de dispersión lateral (90°) para muestras con dispersión débil, incluidas partículas pequeñas y muestras transparentes. Finalmente, la detección de dispersión directa (por ejemplo, 13° o 15°) es adecuada para la detección de muestras que contienen partículas pequeñas con pocas partículas grandes. Algunos instrumentos DLS en el mercado también permiten la selección automática de ángulo basada en una medición continua de transmitancia.

En el extremo inferior del rango de turbidez, el método de espectroscopía de dispersión amplificada por cavidad ^[6] utiliza una cavidad integradora para alargar las trayectorias de los fotones a través de muestras casi sin dispersión. A diferencia de los instrumentos DLS convencionales, este método es independiente del ángulo ya que explora muestras isotrópicamente desde todas las direcciones.

Aunque la medición DLS utilizando una detección de un solo ángulo ha sido la técnica más difundida, la aplicación a muchos sistemas de relevancia científica e industrial ha sido limitada debido a la dispersión múltiple que se encuentra a menudo, en la que los fotones son dispersados ​​varias veces por la muestra antes de ser detectado. La interpretación precisa se vuelve extremadamente difícil para sistemas con contribuciones no despreciables de dispersión múltiple. Especialmente para partículas más grandes y aquellas con alto índice de refracción, esto limita la técnica a concentraciones de partículas muy bajas y, por lo tanto, una gran variedad de sistemas quedan excluidos de las investigaciones con dispersión dinámica de la luz. Sin embargo, como lo muestra Schaetzel, ^[7] es posible suprimir la dispersión múltiple en experimentos de dispersión dinámica de luz mediante un enfoque de correlación cruzada. La idea general es aislar la luz dispersada individualmente y suprimir las contribuciones no deseadas de la dispersión múltiple en un experimento de dispersión de luz dinámica. Se han desarrollado y aplicado diferentes implementaciones de dispersión de luz por correlación cruzada. Actualmente, el esquema más utilizado es el llamado método de dispersión de luz dinámica 3D. ^{[8] [9]} El mismo método también se puede utilizar para corregir datos de dispersión de luz estática para múltiples contribuciones de dispersión. ^[10] Alternativamente, en el límite de una fuerte dispersión múltiple, se puede aplicar una variante de la dispersión dinámica de la luz llamada espectroscopia de onda difusora .

Análisis de los datos

Introducción

Una vez que se han generado los datos de autocorrelación, se pueden emplear diferentes enfoques matemáticos para obtener "información" de ellos. El análisis de la dispersión se facilita cuando las partículas no interactúan mediante colisiones o fuerzas electrostáticas entre iones. Las colisiones entre partículas se pueden suprimir mediante dilución y los efectos de carga se reducen mediante el uso de sales para colapsar la doble capa eléctrica .

El enfoque más simple es tratar la función de autocorrelación de primer orden como una caída exponencial única. Esto es apropiado para una población monodispersa.

${\displaystyle \ g^{1}(q;\tau )=\exp(-\Gamma \tau )\,}$

donde Γ es la tasa de descomposición. El coeficiente de difusión traslacional Dt _puede derivarse en un solo ángulo o en un rango de ángulos dependiendo del vector de onda q .

${\displaystyle \ \Gamma =q^{2}D_{t}\,}$

con

${\displaystyle \ q={\frac {4\pi n_{0}}{\lambda }}\sin \left({\frac {\theta }{2}}\right)}$

donde λ es la longitud de onda del láser incidente, n ₀ es el índice de refracción del disolvente y θ es el ángulo en el que se ubica el detector con respecto a la celda de muestra.

El índice de refracción del disolvente juega un papel crucial en la dispersión de la luz y es importante para calcular el radio de Stokes a partir de la ecuación de Stokes-Einstein . ^{[11] [12] [13]} Por lo tanto, los datos previos del índice de refracción del medio de dispersión deben evaluarse con instrumentos dedicados, conocidos como refractómetros . Alternativamente, los instrumentos DLS que contienen un módulo de medición del índice de refracción permiten una buena estimación de este importante parámetro dentro de ±0,5 %, que es la precisión definida por la norma ISO 22412:2017 ^{[14] [15]} para los valores del índice de refracción requeridos para DLS. Además del índice de refracción del medio, el índice de refracción de las partículas sólo es necesario cuando se analizan tamaños de partículas más grandes (normalmente por encima de 100 nm) y se necesitan distribuciones de tamaño ponderadas en volumen o en número. En estos casos, se requiere conocimiento previo del índice de refracción y absorbancia del material para poder aplicar la dispersión de Mie . ^{[16] [17]}

Dependiendo de la anisotropía y polidispersidad del sistema, una gráfica resultante de (Γ/ q ² ) vs. q ² puede mostrar o no una dependencia angular. Las partículas esféricas pequeñas no mostrarán dependencia angular y, por tanto, no tendrán anisotropía. Una gráfica de (Γ/ q ² ) frente a q ² dará como resultado una línea horizontal. Las partículas con una forma distinta a la de una esfera mostrarán anisotropía y, por lo tanto, una dependencia angular al representar (Γ/ q ² ) ​​frente a q ² . ^[18] La intersección será en cualquier caso la D _t . Por tanto, existe un ángulo de detección óptimo θ para cada tamaño de partícula. Siempre se debe realizar un análisis de alta calidad en varios ángulos de dispersión (DLS multiángulo). Esto se vuelve aún más importante en una muestra polidispersa con una distribución de tamaño de partícula desconocida. En ciertos ángulos, la intensidad de dispersión de algunas partículas superará por completo la débil señal de dispersión de otras partículas, haciéndolas así invisibles para el análisis de datos en este ángulo. Los instrumentos DLS que sólo funcionan en un ángulo fijo sólo pueden ofrecer buenos resultados con algunas partículas. Por lo tanto, la precisión indicada de un instrumento DLS con un solo ángulo de detección solo es válida para determinadas partículas.

D _t se utiliza a menudo para calcular el radio hidrodinámico de una esfera mediante la ecuación de Stokes-Einstein. Es importante señalar que el tamaño determinado por la dispersión dinámica de la luz es el tamaño de una esfera que se mueve de la misma manera que el difusor. Entonces, por ejemplo, si el dispersor es un polímero en espiral aleatorio, el tamaño determinado no es el mismo que el radio de giro determinado por la dispersión de luz estática . También es útil señalar que el tamaño obtenido incluirá cualquier otra molécula o molécula de disolvente que se mueva con la partícula. Así, por ejemplo, el oro coloidal con una capa de tensioactivo aparecerá más grande mediante la dispersión dinámica de la luz (que incluye la capa de tensioactivo) que mediante microscopía electrónica de transmisión (que no "ve" la capa debido al bajo contraste).

En la mayoría de los casos, las muestras son polidispersas. Así, la función de autocorrelación es una suma de las desintegraciones exponenciales correspondientes a cada una de las especies de la población.

${\displaystyle g^{1}(q;\tau )=\sum _{i=1}^{n}G_{i}(\Gamma _{i})\exp(-\Gamma _{i}\tau )=\int G(\Gamma )\exp(-\Gamma \tau )\,d\Gamma .}$

Es tentador obtener datos para g ¹ ( q ; τ ) e intentar invertir lo anterior para extraer G (Γ) . Dado que G (Γ) es proporcional a la dispersión relativa de cada especie, contiene información sobre la distribución de tamaños. Sin embargo, esto se conoce como un problema mal planteado . Los métodos que se describen a continuación (y otros) se han desarrollado para extraer la mayor cantidad de información útil posible de una función de autocorrelación.

método acumulativo

Uno de los métodos más comunes es el método acumulativo , ^{[19] [20]} del cual, además de la suma de los exponenciales anteriores, se puede derivar más información sobre la varianza del sistema de la siguiente manera:

${\displaystyle \ g^{1}(q;\tau )=\exp \left(-{\bar {\Gamma }}\left(\tau -{\frac {\mu _{2}}{2!}}\tau ^{2}+{\frac {\mu _{3}}{3!}}\tau ^{3}+\cdots \right)\right)}$

donde Γ es la tasa de desintegración promedio y μ ₂ / Γ ² es el índice de polidispersidad de segundo orden (o una indicación de la varianza). También se puede derivar un índice de polidispersidad de tercer orden, pero esto sólo es necesario si las partículas del sistema están muy polidispersas. El coeficiente de difusión traslacional promediado z D _z puede derivarse en un solo ángulo o en un rango de ángulos dependiendo del vector de onda q .

${\displaystyle \ {\bar {\Gamma }}=q^{2}D_{z}\,}$

Hay que tener en cuenta que el método acumulativo es válido para τ pequeño y G ( Γ ) suficientemente estrecho . ^[21] Rara vez se deben usar parámetros más allá de μ ₃ , porque el sobreajuste de datos con muchos parámetros en una expansión de series de potencias hará que todos los parámetros, incluidos y μ ₂ , sean menos precisos. ^[22] El método acumulativo se ve mucho menos afectado por el ruido experimental que los métodos siguientes. ${\displaystyle \scriptstyle {\bar {\Gamma }}}$

Función de distribución de tamaño

La distribución del tamaño de partículas también se puede obtener utilizando la función de autocorrelación. Sin embargo, las muestras polidispersas no se resuelven bien mediante el análisis de ajuste de acumuladores. Por tanto, la combinación de algoritmos de mínimos cuadrados no negativos (NNLS) con métodos de regularización, como la regularización de Tikhonov , se puede utilizar para resolver muestras multimodales. ^[16] Una característica importante de la optimización NNLS es el término de regularización utilizado para identificar soluciones específicas y minimizar la desviación entre los datos de medición y el ajuste. No existe un término de regularización ideal que sea adecuado para todas las muestras. La forma de este término puede determinar si la solución representará una distribución amplia general con un pequeño número de picos o si se ajustarán poblaciones estrechas y discretas. Alternativamente, el cálculo de la distribución del tamaño de partículas se realiza utilizando el algoritmo CONTIN.

Algoritmo CONTIN

Se puede lograr un método alternativo para analizar la función de autocorrelación mediante una transformada inversa de Laplace conocida como CONTIN desarrollada por Steven Provencher. ^{[23] [24]} El análisis CONTIN es ideal para sistemas heterodispersos, polidispersos y multimodales que no se pueden resolver con el método acumulativo. La resolución para separar dos poblaciones de partículas diferentes es aproximadamente un factor de cinco o más y la diferencia en intensidades relativas entre dos poblaciones diferentes debe ser inferior a 1:10 ⁻⁵ .

Método de máxima entropía

El método de máxima entropía es un método de análisis que tiene un gran potencial de desarrollo. El método también se utiliza para la cuantificación de datos de velocidad de sedimentación procedentes de ultracentrifugación analítica . El método de máxima entropía implica varios pasos iterativos para minimizar la desviación de los datos ajustados de los datos experimentales y posteriormente reducir la χ ² de los datos ajustados.

Dispersión de partículas no esféricas.

Si la partícula en cuestión no es esférica, también se debe considerar el movimiento de rotación porque la dispersión de la luz será diferente según la orientación. Según Pecora, el movimiento browniano de rotación afectará a la dispersión cuando una partícula cumpla dos condiciones; deben ser anisotrópicos tanto óptica como geométricamente. ^[25] Las moléculas en forma de varilla cumplen estos requisitos, por lo que se debe considerar un coeficiente de difusión rotacional además de un coeficiente de difusión traslacional. En su forma más sucinta, la ecuación aparece como

${\displaystyle {\frac {A}{B}}={\frac {5}{4}}{\frac {4\mathrm {M} _{p}+2\mathrm {N} \mathrm {M} _{l}\mathrm {M} _{p}+\mathrm {M} _{l}}{\mathrm {M} _{p}-\mathrm {N} +\mathrm {M} _{l}}}}$

Donde A / B es la relación de los dos modos de relajación (traslacional y rotacional), M _p contiene información sobre el eje perpendicular al eje central de la partícula y M _l contiene información sobre el eje paralelo al eje central.

En 2007, Peter R. Lang y su equipo decidieron utilizar la dispersión dinámica de la luz para determinar la longitud de las partículas y la relación de aspecto de nanobarras de oro cortas. ^[26] Eligieron este método porque no destruye la muestra y tiene una configuración relativamente fácil. Ambos estados de relajación se observaron en la geometría VV y los coeficientes de difusión de ambos movimientos se utilizaron para calcular las relaciones de aspecto de las nanopartículas de oro.

Aplicaciones

DLS se utiliza para caracterizar el tamaño de varias partículas, incluidas proteínas, ^[27] polímeros, micelas, ^[28] jaulas de proteínas y partículas similares a virus, ^{[29] [30]} vesículas, ^[31] carbohidratos, nanopartículas, células biológicas, ^{[ 32]} y geles. ^[33] Si el sistema no tiene un tamaño disperso, se puede determinar el diámetro medio efectivo de las partículas. Esta medida depende del tamaño del núcleo de la partícula, el tamaño de las estructuras superficiales, la concentración de partículas y el tipo de iones en el medio.

Dado que DLS esencialmente mide las fluctuaciones en la intensidad de la luz dispersada debido a las partículas en difusión, se puede determinar el coeficiente de difusión de las partículas. El software DLS de los instrumentos comerciales normalmente muestra la población de partículas en diferentes diámetros. Si el sistema es monodisperso, solo debería haber una población, mientras que un sistema polidisperso mostraría múltiples poblaciones de partículas. Si hay más de un tamaño de población presente en una muestra, entonces se debe aplicar el análisis CONTIN para los instrumentos de espectroscopía de correlación de fotones, o se debe aplicar el método del espectro de potencia para los instrumentos de desplazamiento Doppler.

Los estudios de estabilidad se pueden realizar cómodamente utilizando DLS. Las mediciones DLS periódicas de una muestra pueden mostrar si las partículas se agregan con el tiempo al ver si aumenta el radio hidrodinámico de la partícula. Si las partículas se agregan, habrá una población mayor de partículas con un radio mayor. En algunas máquinas DLS, la estabilidad en función de la temperatura se puede analizar controlando la temperatura in situ .

Ver también

• Microscopía dinámica diferencial.
• Dispersión diferencial de luz estática (DSLS)
• Espectroscopía de ondas difusoras
• Coeficiente de difusión
• Espectroscopia de correlación de fluorescencia.
• Microscopía de dispersión interferométrica.
• Dispersión de la luz
• Dispersión de luz multiángulo
• Análisis de seguimiento de nanopartículas.
• Interacciones proteína-proteína
• Detección de oclusión de iones de escaneo
• Dispersión de luz estática
• Radio de Stokes

Referencias

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enlaces externos

• DLS para determinar el radio de pequeñas perlas en movimiento browniano en una solución
• Dimensionamiento de partículas mediante DLS
• Dispersión dinámica de luz para la caracterización del tamaño de partículas de proteínas, polímeros y dispersiones coloidales.