El intercambio hidrógeno-deuterio (también llamado intercambio H-D o H/D) es una reacción química en la que un átomo de hidrógeno unido covalentemente se reemplaza por un átomo de deuterio , o viceversa. Se puede aplicar más fácilmente a protones y deuterones intercambiables, donde dicha transformación se produce en presencia de una fuente de deuterio adecuada, sin ningún catalizador. El uso de catalizadores ácidos, básicos o metálicos, junto con condiciones de mayor temperatura y presión, puede facilitar el intercambio de átomos de hidrógeno no intercambiables, siempre que el sustrato sea resistente a las condiciones y reactivos empleados. Esto a menudo resulta en perdeuteración: intercambio hidrógeno-deuterio de todos los átomos de hidrógeno no intercambiables en una molécula.
Un ejemplo de protones intercambiables que comúnmente se examinan de esta manera son los protones de las amidas en la columna vertebral de una proteína . [1] [2] [3] El método proporciona información sobre la accesibilidad al disolvente de varias partes de la molécula y, por tanto, de la estructura terciaria de la proteína. El marco teórico para comprender el intercambio de hidrógeno en las proteínas fue descrito por primera vez por Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang y fue el primero en aplicar el intercambio H/D para estudiar las proteínas. [4]
En la solución prótica, los protones intercambiables, como los del grupo hidroxilo o amina, intercambian protones con el disolvente . Si el D 2 O es disolvente, se incorporarán deuterones en estas posiciones. La reacción de intercambio se puede seguir utilizando una variedad de métodos (ver Detección). Dado que este intercambio es una reacción de equilibrio, la cantidad molar de deuterio debería ser alta en comparación con los protones intercambiables del sustrato. Por ejemplo, se añade deuterio a una proteína en H2O diluyendo la solución de H2O con D2O ( por ejemplo, diez veces). Por lo general, el intercambio se realiza a un pH fisiológico (7,0 a 8,0), donde las proteínas se encuentran en su conjunto más nativo de estados conformacionales. [5] [6]
La reacción de intercambio H/D también puede catalizarse mediante catalizadores ácidos, básicos o metálicos como el platino. Para los átomos de hidrógeno de la amida principal de las proteínas, el tipo de intercambio mínimo se produce aproximadamente a pH 2,6, en promedio. Al realizar el intercambio a pH neutro y luego cambiar rápidamente el pH, las tasas de intercambio de los hidrógenos de la amida principal pueden reducirse drásticamente o apagarse . El pH al que se apaga la reacción depende del método de análisis. Para la detección por RMN, el pH se puede mover a alrededor de 4,0 a 4,5. Para la detección por espectrometría de masas, el pH se reduce al mínimo de la curva de intercambio, pH 2,6. En el experimento más básico, se deja que la reacción tenga lugar durante un tiempo determinado antes de apagarla.
El patrón de deuteración de una molécula que ha experimentado un intercambio H/D puede mantenerse en ambientes apróticos. Sin embargo, algunos métodos de análisis de deuteración para moléculas como las proteínas se realizan en solución acuosa, lo que significa que el intercambio continuará a un ritmo lento incluso después de que se detenga la reacción. El intercambio no deseado deuterio-hidrógeno se conoce como retrointercambio y se han ideado varios métodos para corregirlo.
El intercambio H-D fue medido originalmente por el padre del intercambio de hidrógeno, Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang, utilizando tubos de gradiente de densidad. En los tiempos modernos, el intercambio H-D se ha controlado principalmente mediante métodos: espectroscopia de RMN , espectrometría de masas y cristalografía de neutrones . Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas y desventajas.
Los núcleos de hidrógeno y deuterio son muy diferentes en sus propiedades magnéticas. Por tanto, es posible distinguirlos mediante espectroscopia de RMN . Los deuterones no se observarán en un espectro de 1 H NMR y, a la inversa, no se observarán protones en un espectro de 2 H NMR. Cuando se observan pequeñas señales en un espectro de 1H NMR de una muestra altamente deuterada, se las denomina señales residuales. Se pueden utilizar para calcular el nivel de deuteración en una molécula. No se observan señales análogas en los espectros de 2 H NMR debido a la baja sensibilidad de esta técnica en comparación con el análisis de 1 H. Los deuterones suelen exhibir cambios químicos muy similares a los de sus protones análogos. También es posible el análisis mediante espectroscopia de 13 C NMR: los diferentes valores de espín del hidrógeno ( 1 / 2 ) y del deuterio (1) dan lugar a diferentes multiplicidades de división. La espectroscopia de RMN se puede utilizar para determinar la deuteración de moléculas en un sitio específico.
Otro método utiliza espectros HSQC. Normalmente, los espectros HSQC se registran en una serie de puntos de tiempo mientras el hidrógeno se intercambia con el deuterio. Dado que el experimento HSQC es específico para el hidrógeno, la señal decaerá exponencialmente a medida que el hidrógeno se intercambie. Entonces es posible ajustar una función exponencial a los datos y obtener la constante de intercambio. Este método proporciona información específica de residuos para todos los residuos de la proteína simultáneamente [7] [8] El principal inconveniente es que requiere una asignación previa del espectro para la proteína en cuestión. Esto puede requerir mucha mano de obra y normalmente limita el método a proteínas de menos de 25 kDa . Debido a que se necesitan minutos u horas para registrar un espectro HSQC, las amidas que se intercambian rápidamente deben medirse utilizando otras secuencias de pulsos.
La espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HX-MS o HDX-MS) puede determinar el contenido total de deuterio de las moléculas que se han sometido a un intercambio H/D. Debido a la preparación de la muestra requerida, normalmente se considera que proporciona una medición precisa únicamente de átomos de hidrógeno no intercambiables. También puede implicar el intercambio H/D en la fase gaseosa [9] o el intercambio en fase solución antes de la ionización. [3] Tiene varias ventajas en espectroscopía de RMN con respecto al análisis de reacciones de intercambio H-D: se necesita mucho menos material, la concentración de la muestra puede ser muy baja (tan baja como 0,1 uM), el límite de tamaño es mucho mayor, y los datos generalmente se pueden recopilar e interpretar mucho más rápidamente. [10]
El núcleo de deuterio pesa el doble que el de hidrógeno porque contiene un neutrón además de un protón. Por tanto, una molécula que contenga algo de deuterio será más pesada que una que contenga todo hidrógeno. A medida que una proteína se deutera cada vez más, la masa molecular aumenta en consecuencia. La detección del cambio en la masa de una proteína tras la deuteración fue posible gracias a la moderna espectrometría de masas de proteínas, informada por primera vez en 1991 por Katta y Chait. [11]
Determinar la deuteración específica del sitio mediante espectrometría de masas es más complicado que usar espectroscopía de RMN. Por ejemplo, la ubicación y la cantidad relativa del intercambio de deuterio a lo largo de la cadena principal del péptido se pueden determinar de manera aproximada sometiendo la proteína a proteólisis después de que se haya apagado la reacción de intercambio. Luego se analizan los péptidos individuales para determinar la deuteración general de cada fragmento peptídico. Con esta técnica, la resolución del intercambio de deuterio está determinada por el tamaño de los péptidos producidos durante la digestión. [12] La pepsina , una proteasa ácida , se usa comúnmente para la proteólisis, ya que el pH de extinción debe mantenerse durante la reacción proteolítica. Para minimizar el intercambio, la proteólisis y el posterior análisis de espectrometría de masas deben realizarse lo más rápido posible. La separación por HPLC del digesto péptico a menudo se lleva a cabo a baja temperatura justo antes de la espectrometría de masas por electropulverización para minimizar el intercambio inverso. Más recientemente, se ha utilizado UPLC debido a sus capacidades superiores de separación. [13]
En 1999 se propuso que podría ser posible lograr una resolución de un solo residuo mediante el uso de la fragmentación por disociación inducida por colisión (CID) de péptidos deuterados junto con la espectrometría de masas en tándem . Pronto se descubrió que la CID provoca una "codificación" de la posición del deuterio dentro de los péptidos. [14] [15] Sin embargo, la fragmentación producida por la desintegración en la fuente MALDI (ISD), la disociación por captura de electrones (ECD) y la disociación por transferencia de electrones (ETD) se produce con poca o ninguna codificación en las condiciones experimentales correctas. [16] [17] [18] La codificación del etiquetado isotópico es causada por el calentamiento por colisión antes de la disociación del ion y, si bien el CID causa codificación, el calentamiento por colisión también puede ocurrir durante la ionización y el transporte de iones. [19] Sin embargo, mediante una optimización cuidadosa de los parámetros del instrumento que causan el calentamiento de iones, la codificación del hidrógeno se puede minimizar hasta un grado que preserve el marcaje isotópico de la fase de solución hasta que la fragmentación se pueda realizar utilizando una técnica en la que no se produzca la codificación. [17] [18] [20] [21] Más recientemente, la fotodisociación ultravioleta (UVPD) también se ha investigado como una posible técnica de fragmentación para localizar el deuterio dentro de péptidos y proteínas. [22] [23] A este respecto, las conclusiones han sido mixtas, si bien es posible obtener fragmentos de UVPD que no han sido objeto de codificación bajo ciertas condiciones, otros han demostrado que puede ocurrir codificación tanto para péptidos como para proteínas durante el paso de fragmentación de UVPD. sí mismo. [22] [23] La teoría que consolida estas aparentes contradicciones tiene que ver con la vía de fragmentación dual que puede surgir de la irradiación UV de péptidos y proteínas, es decir, la disociación directa y estadística. [24] Es decir, si las condiciones experimentales favorecen la disociación directa y el ion precursor se mantiene a bajas energías internas antes y durante la fragmentación, el nivel de deuterio de los fragmentos resultantes corresponderá al precursor no codificado. [22] Sin embargo, las condiciones experimentales pueden favorecer la disociación estadística durante la irradiación UV, especialmente en tiempos de irradiación prolongados y baja presión de gas, lo que lleva a la conversión interna de la energía de excitación electrónica aportada por los fotones UV. [23] El resultado es la excitación vibratoria de la molécula irradiada que a su vez sufre una codificación.
El intercambio hidrógeno-deuterio de especies de intercambio rápido (por ejemplo, grupos hidroxilo) se puede medir cuantitativamente con resolución atómica mediante cristalografía de neutrones y en tiempo real si el intercambio se realiza durante el experimento de difracción.
Los haces de neutrones de alta intensidad generalmente se generan por espalación en aceleradores de partículas linac como la fuente de neutrones de espalación . Los neutrones difractan los cristales de forma similar a los rayos X y pueden utilizarse para la determinación estructural. Los átomos de hidrógeno, con entre uno y cero electrones en un entorno biológico, difractan mal los rayos X y son efectivamente invisibles en condiciones experimentales normales. Los neutrones se dispersan desde los núcleos atómicos y, por tanto, son capaces de detectar átomos de hidrógeno y deuterio.
Los átomos de hidrógeno se reemplazan habitualmente con deuterio, lo que introduce un factor de dispersión fuerte y positivo. A menudo es suficiente reemplazar sólo el disolvente y los átomos de hidrógeno lábiles en un cristal de proteína mediante difusión de vapor. En tal estructura, la ocupación de un átomo de deuterio intercambiable en un cristal se refinará entre 0 y 100%, cuantificando directamente la cantidad de intercambio.
La perdeuteración de un componente de un sistema de múltiples componentes puede proporcionar contraste para experimentos de dispersión de neutrones , donde el contraste obtenido mediante el uso de disolventes deuterados es insuficiente. [ cita necesaria ]
No es posible determinar la estructura de una proteína con intercambio H/D aparte de la cristalografía de neutrones ni es posible definir elementos estructurales secundarios. Las razones de esto están relacionadas con la forma en que la estructura de las proteínas ralentiza el intercambio. Los tipos de cambio son función de dos parámetros: la accesibilidad al disolvente y los enlaces de hidrógeno. Así, una amida que forma parte de un enlace de hidrógeno intramolecular se intercambiará lentamente, si es que se intercambia, mientras que una amida en la superficie de una proteína unida por hidrógeno al agua se intercambiará rápidamente. Las amidas enterradas en el disolvente pero no unidas por enlaces de hidrógeno también pueden tener tipos de cambio muy lentos. Debido a que tanto la accesibilidad al disolvente como los enlaces de hidrógeno contribuyen al tipo de cambio, resulta difícil atribuir un tipo de cambio determinado a un elemento estructural sin cristalografía o datos estructurales de RMN.
El intercambio H – D se ha utilizado para caracterizar la vía de plegamiento de proteínas, replegando la proteína en condiciones de intercambio. En un experimento de intercambio directo (H a D), se agrega un pulso de deuterio después de varios períodos de tiempo de replegamiento. Las partes de la estructura que se forman rápidamente quedarán protegidas y, por tanto, no se intercambiarán, mientras que las áreas que se pliegan tarde en el camino quedarán expuestas al intercambio durante períodos de tiempo más prolongados. Por tanto, el intercambio H/D se puede utilizar para determinar la secuencia de varios eventos de plegamiento. Los factores que determinan la resolución temporal de este enfoque son la eficiencia de la mezcla y la rapidez con la que se puede realizar el enfriamiento después del etiquetado.
El intercambio H – D se ha utilizado para caracterizar las estructuras de las proteínas [25] y las interacciones proteína-proteína. [26] La reacción de intercambio debe realizarse con las proteínas aisladas y con el complejo. Luego se comparan las regiones de intercambio. Si una región queda enterrada por la unión, las amidas de esta región pueden quedar protegidas en el complejo e intercambiarse lentamente. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el intercambio H-D no se puede utilizar para localizar interfaces de unión para todas las interacciones proteína-proteína. Algunas interacciones proteína-proteína son impulsadas por fuerzas electrostáticas de las cadenas laterales y es poco probable que cambien la tasa de intercambio de los hidrógenos de la amida principal, particularmente si los hidrógenos de la amida están ubicados en elementos estructurales estables como las hélices alfa .
Por último, el intercambio H – D se puede utilizar para monitorear los cambios conformacionales en las proteínas en relación con la función de las proteínas. Si la conformación se altera como resultado de una modificación postraduccional , activación enzimática, unión de fármacos u otros eventos funcionales, es probable que se pueda detectar un cambio en el intercambio H/D. [27]
HDXsite es un servidor web en línea que incluye algunas aplicaciones, como el modelador HDX, que aumenta la resolución de datos HDX experimentales y modela factores de protección para residuos individuales. [28] [29]