Despliegue del equilibrio

Proceso de bioquímica

En bioquímica , el desdoblamiento en equilibrio es el proceso de desplegar una molécula de proteína o ARN cambiando gradualmente su entorno, como cambiando la temperatura o la presión , el pH , agregando desnaturalizantes químicos o aplicando fuerza como con la punta de un microscopio de fuerza atómica . ^{[1] [2]} Si el equilibrio se mantuviera en todos los pasos, el proceso teóricamente debería ser reversible durante el plegamiento en equilibrio . El desdoblamiento en equilibrio se puede utilizar para determinar la estabilidad termodinámica de la estructura de la proteína o el ARN, es decir, la diferencia de energía libre entre los estados plegado y desplegado .

Fundamento teórico

En su forma más simple, el desdoblamiento en equilibrio supone que la molécula puede pertenecer a solo dos estados termodinámicos, el estado plegado (normalmente denominado N para el estado "nativo") y el estado desplegado (normalmente denominado U ). Este modelo de "todo o nada" de plegamiento de proteínas fue propuesto por primera vez por Tim Anson en 1945, ^[3] pero se cree que solo es válido para dominios estructurales pequeños y únicos de proteínas (Jackson, 1998); los dominios más grandes y las proteínas multidominio a menudo exhiben estados intermedios. Como es habitual en la mecánica estadística , estos estados corresponden a conjuntos de conformaciones moleculares, no solo a una conformación.

La molécula puede pasar del estado nativo al desplegado según un modelo cinético simple.

N ⇌ U

con constantes de velocidad y para las reacciones de plegado ( ) y desplegado ( ), respectivamente. La constante de equilibrio adimensional se puede utilizar para determinar la estabilidad conformacional mediante la ecuación ${\displaystyle k_{f}}$ ${\displaystyle k_{u}}$ ${\displaystyle {\ce {U -> N}}}$ ${\displaystyle {\ce {N -> U}}}$ ${\displaystyle K_{eq}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{u}}{k_{f}}}={\frac {\left[{\ce {U}}\right]_{eq}}{\left[{\ce {N}}\right]_{eq}}}}$ ${\displaystyle \Delta G^{o}}$

${\displaystyle \Delta G^{o}=-RT\ln K_{eq}}$

donde es la constante de los gases y es la temperatura absoluta en kelvin . Por lo tanto, es positivo si el estado desplegado es menos estable (es decir, desfavorecido) en relación con el estado nativo. ${\displaystyle R}$ ${\displaystyle T}$ ${\displaystyle \Delta G^{o}}$

La forma más directa de medir la estabilidad conformacional de una molécula con plegamiento en dos estados es medir sus constantes de velocidad cinética y en las condiciones de solución de interés. Sin embargo, dado que el plegamiento de proteínas normalmente se completa en milisegundos, estas mediciones pueden ser difíciles de realizar, y suelen requerir costosos mezcladores de flujo detenido o (más recientemente) de flujo continuo para provocar el plegamiento con una alta resolución temporal. La interferometría de polarización dual es una técnica emergente para medir directamente el cambio conformacional y . ${\displaystyle \Delta G^{o}}$ ${\displaystyle k_{f}}$ ${\displaystyle k_{u}}$ ${\displaystyle \Delta G^{o}}$

Desnaturalización química

En la técnica menos extensa de desdoblamiento en equilibrio , las fracciones de moléculas plegadas y desdobladas (denotadas como y , respectivamente) se miden a medida que las condiciones de la solución se cambian gradualmente de aquellas que favorecen el estado nativo a aquellas que favorecen el estado desplegado, por ejemplo, agregando un desnaturalizante como clorhidrato de guanidinio o urea . (En el plegado en equilibrio , se lleva a cabo el proceso inverso). Dado que las fracciones deben sumar uno y su relación debe estar dada por el factor de Boltzmann , tenemos ${\displaystyle p_{N}}$ ${\displaystyle p_{U}}$

${\displaystyle p_{N}={\frac {1}{1+e^{-\Delta G/RT}}}}$

${\displaystyle p_{U}=1-p_{N}={\frac {e^{-\Delta G/RT}}{1+e^{-\Delta G/RT}}}={\frac {1}{1+e^{\Delta G/RT}}}}$

Se ha comprobado que la estabilidad de las proteínas varía linealmente con la concentración de desnaturalizante. Se han propuesto varios modelos para explicar esta observación, entre los que se destacan el modelo de unión de desnaturalizante , el modelo de intercambio de disolventes (ambos de John Schellman ^[4] ) y el modelo de extrapolación lineal (LEM, de Nick Pace ^[5] ). Todos los modelos suponen que solo se llenan o despoblan dos estados termodinámicos tras la desnaturalización. Se podrían ampliar para interpretar esquemas de reacción más complicados.

El modelo de unión del desnaturalizante supone que existen sitios específicos pero independientes en la molécula de proteína (plegada o desplegada) a los que se une el desnaturalizante con una constante de unión efectiva (promedio) k . El equilibrio se desplaza hacia el estado desplegado a altas concentraciones de desnaturalizante, ya que tiene más sitios de unión para el desnaturalizante en relación con el estado plegado ( ). En otras palabras, el mayor número de sitios potenciales expuestos en el estado desplegado se considera la razón de las transiciones de desnaturalización. Un tratamiento elemental da como resultado la siguiente forma funcional: ${\displaystyle \Delta n}$

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+k[D]\right)}$

donde es la estabilidad de la proteína en agua y [D] es la concentración de desnaturalizante. Por lo tanto, el análisis de los datos de desnaturalización con este modelo requiere 7 parámetros: , , k , y las pendientes e intersecciones de las líneas base de los estados plegado y desplegado. ${\displaystyle \Delta G_{w}}$ ${\displaystyle \Delta G_{w}}$ ${\displaystyle \Delta n}$

El modelo de intercambio de solventes (también llamado "modelo de enlace débil" o "solvatación selectiva") de Schellman invoca la idea de un equilibrio entre las moléculas de agua unidas a sitios independientes en la proteína y las moléculas desnaturalizantes en solución. Tiene la forma:

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+(K-1)X_{D}\right)}$

donde es la constante de equilibrio para la reacción de intercambio y es la fracción molar del desnaturalizante en solución. Este modelo intenta responder a la pregunta de si las moléculas desnaturalizantes realmente se unen a la proteína o parecen estar unidas simplemente porque los desnaturalizantes ocupan alrededor del 20-30% del volumen total de la solución a altas concentraciones utilizadas en los experimentos, es decir, efectos no específicos, y de ahí el término "unión débil". Al igual que en el modelo de unión del desnaturalizante, el ajuste a este modelo también requiere 7 parámetros. Un tema común obtenido de ambos modelos es que las constantes de unión (en la escala molar) para la urea y el clorhidrato de guanidinio son pequeñas: ~ 0,2 para la urea y 0,6 para GuHCl. ${\displaystyle K}$ ${\displaystyle X_{d}}$ ${\displaystyle M^{-1}}$ ${\displaystyle M^{-1}}$

Intuitivamente, la diferencia en el número de sitios de unión entre los estados plegado y desplegado es directamente proporcional a las diferencias en el área superficial accesible. Esto forma la base para el LEM que supone una dependencia lineal simple de la estabilidad en la concentración de desnaturalizante. La pendiente resultante de la gráfica de estabilidad versus la concentración de desnaturalizante se llama valor m. En términos matemáticos puros, el valor m es la derivada del cambio en la energía libre de estabilización tras la adición de desnaturalizante. Sin embargo, Pace y colaboradores han documentado una fuerte correlación entre el área superficial accesible (ASA) expuesta al desplegado, es decir, la diferencia en el ASA entre el estado desplegado y plegado de la proteína estudiada (dASA), y el valor m. ^[5] En vista de esta observación, los valores m se interpretan típicamente como proporcionales al dASA. No hay una base física para el LEM y es puramente empírico, aunque se utiliza ampliamente para interpretar datos de desnaturalización de disolventes. Tiene la forma general:

${\displaystyle \Delta G=m\left([D]_{1/2}-[D]\right)}$

donde la pendiente se llama " valor m " (> 0 para la definición anterior) y (también llamado C _m ) representa la concentración de desnaturalizante en la que el 50% de las moléculas están plegadas (el punto medio de desnaturalización de la transición, donde ). ${\displaystyle m}$ ${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$ ${\displaystyle p_{N}=p_{U}=1/2}$

En la práctica, los datos experimentales observados a diferentes concentraciones de desnaturalizante se ajustan a un modelo de dos estados con esta forma funcional para , junto con líneas base lineales para los estados plegado y desplegado. Los y son dos parámetros de ajuste, junto con otros cuatro para las líneas base lineales (pendiente e intersección para cada línea); en algunos casos, se supone que las pendientes son cero, lo que da cuatro parámetros de ajuste en total. La estabilidad conformacional se puede calcular para cualquier concentración de desnaturalizante (incluida la estabilidad a cero desnaturalizante) a partir de los parámetros ajustados y . Cuando se combina con datos cinéticos sobre el plegado, el valor m se puede utilizar para estimar aproximadamente la cantidad de superficie hidrófoba enterrada en el estado de transición de plegado. ${\displaystyle \Delta G}$ ${\displaystyle m}$ ${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$ ${\displaystyle \Delta G}$ ${\displaystyle m}$ ${\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}$

Sondas estructurales

Desafortunadamente, las probabilidades y no se pueden medir directamente. En su lugar, ensayamos la población relativa de moléculas plegadas utilizando varias sondas estructurales, por ejemplo, absorbancia a 287 nm (que informa sobre la exposición al solvente del triptófano y la tirosina ), dicroísmo circular ultravioleta lejano (180-250 nm, que informa sobre la estructura secundaria de la cadena principal de la proteína), interferometría de polarización dual (que informa el tamaño molecular y la densidad de plegamiento) y fluorescencia ultravioleta cercana (que informa sobre cambios en el entorno del triptófano y la tirosina). Sin embargo, casi cualquier sonda de estructura plegada funcionará; dado que la medición se toma en equilibrio, no hay necesidad de una alta resolución temporal. Por lo tanto, se pueden realizar mediciones de desplazamientos químicos de RMN , viscosidad intrínseca , exposición al solvente (reactividad química) de cadenas laterales como la cisteína, exposición de la cadena principal a proteasas y varias mediciones hidrodinámicas. ${\displaystyle p_{N}}$ ${\displaystyle p_{U}}$

Para convertir estas observaciones en probabilidades y , generalmente se supone que el observable adopta uno de dos valores, o , correspondientes al estado nativo o desplegado, respectivamente. Por lo tanto, el valor observado es igual a la suma lineal ${\displaystyle p_{N}}$ ${\displaystyle p_{U}}$ ${\displaystyle A}$ ${\displaystyle A_{N}}$ ${\displaystyle A_{U}}$

${\displaystyle A=A_{N}p_{N}+A_{U}p_{U}}$

Al ajustar las observaciones de en diversas condiciones de solución a esta forma funcional, se puede estimar y , así como los parámetros de . A veces se permite que las variables de ajuste y varíen linealmente con las condiciones de la solución, por ejemplo, la temperatura o la concentración de desnaturalizante, cuando se observa que las asíntotas de varían linealmente en condiciones de fuerte plegamiento o fuerte desplegamiento. ${\displaystyle A}$ ${\displaystyle A_{N}}$ ${\displaystyle A_{U}}$ ${\displaystyle \Delta G}$ ${\displaystyle A_{N}}$ ${\displaystyle A_{U}}$ ${\displaystyle A}$

Desnaturalización térmica

Suponiendo una desnaturalización de dos estados como la indicada anteriormente, se pueden derivar los parámetros termodinámicos fundamentales, a saber , y siempre que se tenga conocimiento del sistema bajo investigación. ${\displaystyle \Delta H}$ ${\displaystyle \Delta S}$ ${\displaystyle \Delta G}$ ${\displaystyle \Delta C_{p}}$

Los observables termodinámicos de la desnaturalización se pueden describir mediante las siguientes ecuaciones:

${\displaystyle {\begin{aligned}\Delta H(T)&=\Delta H(T_{d})+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT\\&=\Delta H(T_{d})+\Delta C_{p}[T-T_{d}]\\\Delta S(T)&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\Delta C_{p}\ln {\frac {T}{T_{d}}}\\\Delta G(T)&=\Delta H-T\Delta S\\&=\Delta H(T_{d}){\frac {T_{d}-T}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT-T\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&=\Delta H(T_{d})\left(1-{\frac {T}{T_{d}}}\right)-\Delta C_{p}\left[T_{d}-T+T\ln \left({\frac {T}{T_{d}}}\right)\right]\end{aligned}}}$

donde , y indican la entalpía , la entropía y la energía libre de Gibbs de desdoblamiento bajo un pH y una presión constantes. La temperatura, se varía para probar la estabilidad térmica del sistema y es la temperatura a la que se desdoblan la mitad de las moléculas del sistema. La última ecuación se conoce como ecuación de Gibbs-Helmholtz . ${\displaystyle \ \Delta H}$ ${\displaystyle \ \Delta S}$ ${\displaystyle \ \Delta G}$ ${\displaystyle \ T}$ ${\displaystyle \ T_{d}}$

Determinación de la capacidad térmica de las proteínas

En principio, se pueden calcular todos los observables termodinámicos anteriores a partir de un único termograma de calorimetría diferencial de barrido del sistema suponiendo que es independiente de la temperatura. Sin embargo, es difícil obtener valores precisos de esta manera. Más exactamente, se puede derivar de las variaciones en vs. que se pueden lograr a partir de mediciones con ligeras variaciones en el pH o la concentración de proteínas. La pendiente del ajuste lineal es igual a . Tenga en cuenta que cualquier no linealidad de los puntos de datos indica que probablemente no sea independiente de la temperatura. ${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$ ${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$ ${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$ ${\displaystyle {\ce {\Delta H(T_d)}}}$ ${\displaystyle {\ce {T_d}}}$ ${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$ ${\displaystyle \Delta C_{p}}$

Alternativamente, también se puede estimar a partir del cálculo del área de superficie accesible (ASA) de una proteína antes y después de la desnaturalización térmica de la siguiente manera: ${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$

${\displaystyle {\ce {\Delta ASA}}={\ce {ASA_{unfolded}}}-{\ce {ASA_{native}}}}$

Para las proteínas que tienen una estructura 3D conocida, la se puede calcular a través de programas informáticos como Deepview (también conocido como Swiss PDB Viewer). La se puede calcular a partir de valores tabulados de cada aminoácido a través de la ecuación semiempírica: ${\displaystyle {\ce {ASA_{native}}}}$ ${\displaystyle {\ce {ASA_{unfolded}}}}$

${\displaystyle {\ce {ASA_{unfolded}}}=\left(a_{{\ce {polar}}}\times {\ce {ASA_{polar}}}\right)+\left(a_{{\ce {aromatic}}}\times {\ce {ASA_{aromatic}}}\right)+\left(a_{{\ce {nonpolar}}}\times {\ce {ASA_{nonpolar}}}\right)}$

donde los subíndices polar, no polar y aromático indican las partes de los 20 aminoácidos naturales.

Finalmente, para las proteínas, existe una correlación lineal entre y a través de la siguiente ecuación: ^[6] ${\displaystyle {\ce {\Delta ASA}}}$ ${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}}$

${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}}=0.61\times {\ce {\Delta ASA}}}$

Evaluación del desarrollo de dos estados

Además, se puede evaluar si el plegamiento se produce según un desplegamiento de dos estados como el descrito anteriormente. Esto se puede hacer con calorimetría diferencial de barrido comparando la entalpía calorimétrica de desnaturalización, es decir, el área bajo el pico, con la entalpía de van 't Hoff descrita de la siguiente manera: ${\displaystyle A_{\text{peak}}}$

${\displaystyle \Delta H_{vH}(T)=-R{\frac {d\ln K}{dT^{-1}}}}$

en el se puede describir como: ${\displaystyle T=T_{d}}$ ${\displaystyle \Delta H_{vH}(T_{d})}$

${\displaystyle \Delta H_{vH}(T_{d})={\frac {RT_{d}^{2}\Delta C_{p}^{\max }}{A_{\text{peak}}}}}$

Cuando se observa un desdoblamiento de dos estados , . La es la altura del pico de capacidad térmica. ${\displaystyle A_{\text{peak}}=\Delta H_{vH}(T_{d})}$ ${\displaystyle \Delta C_{p}^{\max }}$

Generalización acomplejos proteicosyproteínas multidominio

Utilizando los principios anteriores, se han derivado ecuaciones que relacionan una señal proteica global, correspondiente a los estados de plegamiento en equilibrio, y el valor variable de un agente desnaturalizante, ya sea la temperatura o una molécula química, para proteínas homoméricas y heteroméricas, desde monómeros hasta trímeros y potencialmente tetrámeros. Estas ecuaciones proporcionan una base teórica sólida para medir la estabilidad de proteínas complejas y para comparar las estabilidades de proteínas de tipo salvaje y mutantes. ^[7] Dichas ecuaciones no se pueden derivar para pentámeros u oligómeros superiores debido a limitaciones matemáticas (teorema de Abel-Ruffini).

Referencias

1. Lassalle, Michael W.; Akasaka, Kazuyuki (2007). "El uso de resonancia magnética nuclear de alta presión para estudiar el plegamiento de proteínas". En Bai, Yawen; Nussinov, Ruth (eds.). Protocolos de plegamiento de proteínas. Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. págs. 21–38. ISBN 1-59745-189-4.
2. Ng, Sean P.; Randles, Lucy G; Clarke, Jane (2007). "El uso de resonancia magnética nuclear de alta presión para estudiar el plegamiento de proteínas". En Bai, Yawen; Nussinov, Ruth (eds.). Protocolos de plegamiento de proteínas. Totowa, Nueva Jersey: Humana Press. págs. 139–167. ISBN 1-59745-189-4.
3. Anson ML, Desnaturalización de proteínas y propiedades de los grupos de proteínas, Avances en química de proteínas, 2, 361-386 (1945)
4. Schellmann, JA, La termodinámica del intercambio de disolventes, Biopolymers 34, 1015–1026 (1994)
5. Myers JK, Pace CN, Scholtz JM, Valores m desnaturalizantes y cambios en la capacidad térmica: relación con los cambios en las áreas superficiales accesibles del despliegue de proteínas, Protein Sci. 4(10), 2138–2148 (1995)
6. Robertson, AD, Murphy, KP Estructura de proteínas y energía de la estabilidad de las proteínas, (1997), Chem Rev , 97 , 1251-1267
7. Bedouelle, Hugues (2016). "Principios y ecuaciones para medir e interpretar la estabilidad de las proteínas: del monómero al tetrámero". Biochimie . 121 : 29–37. doi :10.1016/j.biochi.2015.11.013. PMID  26607240.

Lectura adicional

• Pace CN. (1975) "La estabilidad de las proteínas globulares", CRC Critical Reviews in Biochemistry , 1-43.
• Santoro MM y Bolen DW. (1988) "Despliegue de cambios de energía libre determinados por el método de extrapolación lineal. 1. Despliegue de fenilmetanosulfonil α-quimotripsina utilizando diferentes desnaturalizantes", Biochemistry , 27 , 8063–8068.
• Privalov PL. (1992) "Base física para la estabilidad de las conformaciones plegadas de las proteínas", en Protein Folding , TE Creighton, ed., WH Freeman, págs. 83–126.
• Yao M y Bolen DW. (1995) "¿Qué validez tienen las mediciones de energía libre de desplegamiento inducida por desnaturalizantes? Nivel de conformidad con los supuestos comunes en un rango extendido de estabilidad de la ribonucleasa A", Biochemistry , 34 , 3771–3781.
• Jackson SE. (1998) "¿Cómo se pliegan las proteínas pequeñas de un solo dominio?", Folding & Design , 3 , R81-R91.
• Schwehm JM y Stites WE. (1998) "Aplicación de métodos automatizados para la determinación de la estabilidad conformacional de las proteínas", Métodos en enzimología , 295 , 150–170.