El flujo detenido es una técnica experimental para estudiar reacciones químicas con un tiempo medio del orden de 1 ms, introducida por Britton Chance [1] [2] y ampliada por Quentin Gibson [3] (otras técnicas, como el salto de temperatura método, [4] están disponibles para procesos mucho más rápidos).
La espectrometría de flujo detenido permite estudiar la cinética química de reacciones rápidas (con tiempos medios del orden de milisegundos) en solución. Se utilizó por primera vez principalmente para estudiar reacciones catalizadas por enzimas. Luego, el flujo detenido encontró rápidamente su lugar en casi todos los laboratorios de bioquímica, biofísica y química que necesitaban seguir las reacciones químicas en una escala de tiempo de milisegundos. En su forma más simple, un flujo detenido mezcla dos soluciones. Pequeños volúmenes de soluciones se introducen rápida y continuamente en un mezclador de alta eficiencia. Este proceso de mezcla inicia una reacción extremadamente rápida. La solución recién mezclada viaja a la celda de observación y expulsa el contenido de la celda (la solución restante del experimento anterior o de los pasos de lavado necesarios). El tiempo necesario para que esta solución pase desde el punto de mezcla hasta el punto de observación se conoce como tiempo muerto. El volumen mínimo de inyección dependerá del volumen de la celda de mezcla. Una vez que se ha inyectado suficiente solución para eliminar completamente la solución anterior, el instrumento alcanza un estado estacionario y se puede detener el flujo. Dependiendo de la tecnología de accionamiento de la jeringa, la parada del flujo se logra mediante el uso de una válvula de cierre llamada parada dura o mediante el uso de una jeringa de parada. El flujo detenido también envía una "señal de inicio" al detector llamado disparador para que se pueda observar la reacción. El tiempo del activador suele estar controlado por software, por lo que el usuario puede activarlo al mismo tiempo que se detiene el flujo o unos milisegundos antes de la parada para comprobar que se ha alcanzado el estado estacionario.
Se llenan dos jeringas con soluciones que no sufren una reacción química hasta que se mezclan. Estos tienen pistones que son accionados por un solo pistón de accionamiento o por motores paso a paso independientes, de modo que se acoplan entre sí y su contenido es expulsado simultáneamente a un dispositivo mezclador.
Una vez que las dos soluciones salen de sus jeringas, ingresan a un sistema de mezcla que tiene deflectores para garantizar una mezcla completa, con flujo turbulento en lugar de flujo laminar. (El flujo laminar permitiría que las dos soluciones fluyeran una al lado de la otra sin una mezcla completa).
El tiempo muerto es el tiempo que tardan las soluciones en pasar del punto de mezcla al punto de observación, es la parte de la cinética que no se puede observar. Entonces, cuanto menor sea el tiempo muerto, más información podrá obtener el usuario. En instrumentos más antiguos esto podría ser del orden de 1 ms, pero las mejoras ahora permiten un tiempo muerto de aproximadamente 0,3 ms. [5]
Los reactivos mezclados pasan por una celda de observación que permite seguir la reacción espectrofotométricamente, típicamente mediante espectroscopia ultravioleta , espectroscopia de fluorescencia , dicroísmo circular o dispersión de luz , y ahora es común combinar varios de estos. [6] Las cubetas de observación con un paso de luz corto (0,75 a 1,5 mm) suelen preferirse para mediciones de fluorescencia para reducir los efectos de autoabsorción. Para las mediciones de absorbancia se prefieren las cubetas de observación con un recorrido de luz más largo (de 0,5 cm a 1 cm). El flujo detenido moderno puede acomodar diferentes modelos de células y es posible cambiar la cubeta entre dos experimentos. Para mediciones de rayos X de flujo detenido, se utiliza un capilar de cuarzo con pared delgada para minimizar la absorción de cuarzo. Es posible realizar mediciones simultáneas de rayos X y absorbancia en el mismo capilar.
Una vez a través de la celda de observación, la mezcla ingresa a una tercera jeringa que contiene un pistón que es impulsado por el flujo para activar un interruptor para detener el flujo y activar la observación.
El método de flujo detenido es un desarrollo del método de flujo continuo utilizado por Hamilton Hartridge y Francis Roughton [7] para estudiar la unión del O 2 a la hemoglobina. En ausencia de cualquier sistema de parada, la mezcla de reacción pasaba a un tubo largo pasando por un sistema de observación (que consistía en 1923 en un colorímetro simple) para desechar. Al mover el colorímetro a lo largo del tubo y conocer el caudal, Hartridge y Roughton pudieron medir el proceso después de un tiempo conocido.
En su momento, este fue un avance revolucionario que demostró que un problema aparentemente intratable (estudiar un proceso que tardaba milisegundos con equipos que requerían segundos para cada medición) podía resolverse con equipos simples. Sin embargo, en la práctica se limitó a los reactivos disponibles en grandes cantidades: en el caso de las proteínas, esto efectivamente lo limitó a las reacciones de la hemoglobina. A efectos prácticos, este enfoque es obsoleto.
El método de flujo detenido depende de la existencia de propiedades espectroscópicas que puedan usarse para seguir la reacción. Cuando ese no es el caso, el flujo apagado proporciona una alternativa que utiliza métodos químicos convencionales para el análisis. [8] En lugar de un sistema de parada mecánico, la reacción se detiene mediante enfriamiento , entregando los productos a un recipiente que detiene la reacción inmediatamente, ya sea mediante congelación instantánea o desnaturalizando la enzima con un desnaturalizante químico o exponiendo la muestra a una luz desnaturalizante. fuente. Como en el método de flujo continuo, el tiempo entre la mezcla y el enfriamiento se puede variar variando la longitud del tubo.
El método de flujo templado pulsado introducido por Alan Fersht y Ross Jakes [9] supera la necesidad de un tubo largo. La reacción se inicia exactamente como en un experimento de flujo detenido, pero hay una tercera jeringa que provoca la extinción durante un tiempo definido y preestablecido después del inicio.
El flujo apagado tiene ventajas y desventajas con respecto al flujo detenido. Por un lado, el análisis químico deja claro qué proceso se está midiendo, mientras que no siempre resulta obvio qué proceso representa una señal espectroscópica. Por otro lado, el flujo apagado es mucho más laborioso, ya que cada punto a lo largo del transcurso del tiempo debe determinarse por separado. La imagen de la izquierda para la catálisis por nitrogenasa de Klebsiella pneumoniae [10] ilustra ambos puntos: la concordancia en tiempos medios indica que la absorbancia a 420 nm midió la liberación de Pi , pero el experimento de flujo apagado requirió 11 puntos de datos.