La unión de extremos no homólogos ( NHEJ ) es una vía que repara roturas de doble cadena en el ADN. Se denomina "no homóloga" porque los extremos rotos se ligan directamente sin la necesidad de una plantilla homóloga, en contraste con la reparación dirigida por homología (HDR), que requiere una secuencia homóloga para guiar la reparación. La NHEJ está activa tanto en células que no se dividen como en células que proliferan, mientras que la HDR no es fácilmente accesible en células que no se dividen. [1] El término "unión de extremos no homólogos" fue acuñado en 1996 por Moore y Haber. [2]
La NHEJ suele estar guiada por secuencias cortas de ADN homólogas llamadas microhomologías. Estas microhomologías suelen estar presentes en salientes monocatenarios en los extremos de roturas de doble cadena. Cuando los salientes son perfectamente compatibles, la NHEJ suele reparar la rotura con precisión. [2] [3] [4] [5] También puede producirse una reparación imprecisa que conduzca a la pérdida de nucleótidos, pero es mucho más común cuando los salientes no son compatibles. Una NHEJ inadecuada puede provocar translocaciones y fusión de telómeros , características distintivas de las células tumorales . [6]
Se entiende que las implementaciones de NHEJ han existido en casi todos los sistemas biológicos y es la vía predominante de reparación de roturas de doble cadena en células de mamíferos. [7] Sin embargo, en la levadura en ciernes ( Saccharomyces cerevisiae ), la recombinación homóloga domina cuando el organismo se cultiva en condiciones comunes de laboratorio.
Cuando la vía NHEJ se desactiva, las roturas de doble cadena se pueden reparar mediante una vía más propensa a errores llamada unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ). En esta vía, la resección de extremos revela microhomologías cortas a cada lado de la rotura, que luego se alinean para guiar la reparación. [8] Esto contrasta con la NHEJ clásica, que normalmente utiliza microhomologías ya expuestas en salientes monocatenarios en los extremos de DSB. Por lo tanto, la reparación mediante MMEJ conduce a la eliminación de la secuencia de ADN entre las microhomologías.
Muchas especies de bacterias, incluida Escherichia coli , carecen de una vía de unión de extremos y, por lo tanto, dependen completamente de la recombinación homóloga para reparar las roturas de doble cadena. Se han identificado proteínas NHEJ en varias bacterias, incluidas Bacillus subtilis , Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium smegmatis . [9] [10] Las bacterias utilizan una versión notablemente compacta de NHEJ en la que todas las actividades requeridas están contenidas en solo dos proteínas: un homodímero Ku y la ligasa/polimerasa/nucleasa multifuncional LigD . [11] En las micobacterias, NHEJ es mucho más propensa a errores que en la levadura, y a menudo se agregan y eliminan bases de los extremos de las roturas de doble cadena durante la reparación. [10] Muchas de las bacterias que poseen proteínas NHEJ pasan una parte significativa de su ciclo de vida en una fase haploide estacionaria, en la que no hay disponible una plantilla para la recombinación. [9] La NHEJ puede haber evolucionado para ayudar a estos organismos a sobrevivir a las DSB inducidas durante la desecación. Utiliza preferentemente rNTP (nucleótidos de ARN), posiblemente ventajosos en células latentes. [12]
El sistema NHEJ de las arqueas en Methanocella paludicola tiene un Ku homodímero, pero las tres funciones de LigD se dividen en tres proteínas de dominio único que comparten un operón. Los tres genes mantienen una homología sustancial con sus contrapartes de LigD y la polimerasa mantiene la preferencia por rNTP. [13] El NHEJ se ha perdido y adquirido varias veces en bacterias y arqueas, con una cantidad significativa de transferencia horizontal de genes que reorganiza el sistema entre taxones. [14]
Corndog y Omega, dos micobacteriófagos relacionados de Mycobacterium smegmatis , también codifican homólogos de Ku y explotan la vía NHEJ para recircularizar sus genomas durante la infección. [15] A diferencia de la recombinación homóloga, que se ha estudiado ampliamente en bacterias, la NHEJ se descubrió originalmente en eucariotas y solo se identificó en procariotas en la última década.
A diferencia de las bacterias, la NHEJ en eucariotas utiliza una serie de proteínas , que participan en los siguientes pasos:
En la levadura, el complejo Mre11-Rad50-Xrs2 ( MRX ) se recluta a los DSB de manera temprana y se cree que promueve la unión de los extremos del ADN. [16] El complejo mamífero correspondiente de Mre11-Rad50 - Nbs1 ( MRN ) también está involucrado en la NHEJ, pero puede funcionar en múltiples pasos en la vía más allá de simplemente mantener los extremos en proximidad. [17] También se cree que DNA-PKcs participa en la unión de extremos durante la NHEJ de mamíferos. [18]
La Ku eucariota es un heterodímero que consta de Ku70 y Ku80 , y forma un complejo con DNA-PKcs, que está presente en los mamíferos pero ausente en la levadura . Ku es una molécula con forma de canasta que se desliza sobre el extremo del ADN y se transloca hacia adentro. Ku puede funcionar como un sitio de acoplamiento para otras proteínas NHEJ, y se sabe que interactúa con el complejo de la ADN ligasa IV y XLF . [19] [20]
El procesamiento de los extremos implica la eliminación de nucleótidos dañados o no coincidentes por nucleasas y la resíntesis por parte de las ADN polimerasas. Este paso no es necesario si los extremos ya son compatibles y tienen extremos hidroxilo 3' y fosfato 5'.
Se sabe poco sobre la función de las nucleasas en la NHEJ. Artemis es necesaria para abrir las horquillas que se forman en los extremos del ADN durante la recombinación V(D)J , un tipo específico de NHEJ, y también puede participar en el recorte de extremos durante la NHEJ general. [21] Mre11 tiene actividad de nucleasa, pero parece estar involucrada en la recombinación homóloga , no en la NHEJ.
Las ADN polimerasas de la familia X , Pol λ y Pol μ (Pol4 en levadura ), rellenan los huecos durante la unión NHEJ. [4] [22] [23] Las levaduras que carecen de Pol4 no pueden unirse a los salientes 3' que requieren el llenado de huecos, pero siguen siendo competentes para el llenado de huecos en los salientes 5'. [24] Esto se debe a que el extremo del cebador utilizado para iniciar la síntesis de ADN es menos estable en los salientes 3', lo que requiere una polimerasa NHEJ especializada.
El complejo ADN ligasa IV, que consiste en la subunidad catalítica ADN ligasa IV y su cofactor XRCC4 (Dnl4 y Lif1 en levadura), realiza el paso de ligación de la reparación. [25] XLF , también conocido como Cernunnos, es homólogo a Nej1 de levadura y también es necesario para NHEJ. [26] [27] Si bien se desconoce el papel preciso de XLF , interactúa con el complejo XRCC4/ADN ligasa IV y probablemente participa en el paso de ligación. [28] Evidencias recientes sugieren que XLF promueve la readenilación de la ADN ligasa IV después de la ligación, recargando la ligasa y permitiéndole catalizar una segunda ligación. [29]
En la levadura, Sir2 se identificó originalmente como una proteína NHEJ, pero ahora se sabe que es necesaria para NHEJ solo porque es necesaria para la transcripción de Nej1. [30]
NHEJ y sitios termolábiles
La inducción de sitios termolábiles (HLS) es una característica de la radiación ionizante. Los sitios de daño agrupados en el ADN consisten en diferentes tipos de lesiones del ADN. Algunas de estas lesiones no son DSB inmediatas, pero se convierten en DSB después del calentamiento. Los HLS no evolucionan a DSB a temperatura fisiológica (37 °C). Además, la interacción de los HLS con otras lesiones y su papel en las células vivas aún es esquiva. Los mecanismos de reparación de estos sitios no se han revelado por completo. La NHEJ es la vía de reparación del ADN dominante a lo largo del ciclo celular. La proteína DNA-PKcs es el elemento crítico en el centro de la NHEJ. El uso de líneas celulares KO DNA-PKcs o la inhibición de DNA-PKcs no afecta la capacidad de reparación de los HLS. Además, el bloqueo de las vías de reparación HR y NHEJ por el inhibidor dactolisib (NVP-BEZ235) mostró que la reparación de los HLS no depende de HR y NHEJ. Estos resultados mostraron que el mecanismo de reparación de los HLS es independiente de las vías NHEJ y HR [31].
La elección entre NHEJ y recombinación homóloga para reparar una rotura de doble cadena se regula en el paso inicial de la recombinación, la resección del extremo 5'. En este paso, la cadena 5' de la rotura es degradada por nucleasas para crear largas colas monocatenarias 3'. Las DSB que no han sido resecadas pueden volver a unirse mediante NHEJ, pero la resección de incluso unos pocos nucleótidos inhibe fuertemente a NHEJ y compromete eficazmente la rotura a repararse por recombinación. [23] NHEJ está activo durante todo el ciclo celular, pero es más importante durante G1 cuando no hay disponible una plantilla homóloga para la recombinación. Esta regulación se logra mediante la quinasa dependiente de ciclina Cdk1 ( Cdc28 en levadura), que se desactiva en G1 y se expresa en S y G2 . Cdk1 fosforila la nucleasa Sae2, lo que permite que se inicie la resección. [32]
La NHEJ desempeña un papel fundamental en la recombinación V(D)J , el proceso por el cual se genera la diversidad de receptores de células B y T en el sistema inmunológico de los vertebrados . [33] En la recombinación V(D)J, la nucleasa RAG1/RAG2 crea roturas de doble cadena con protección de horquilla , que escinde el ADN en las secuencias de señal de recombinación. [34] Luego, la nucleasa Artemis abre estas horquillas y las une la NHEJ. [21] Una ADN polimerasa especializada llamada desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que solo se expresa en el tejido linfático, agrega nucleótidos sin plantilla a los extremos antes de que se una la rotura. [35] [36] Este proceso acopla las regiones "variable" (V), "diversidad" (D) y "unión" (J), que cuando se ensamblan crean la región variable de un gen receptor de células B o T. A diferencia de la recombinación celular típica de NHEJ, en la que la reparación precisa es el resultado más favorable, la reparación propensa a errores en la recombinación V(D)J es beneficiosa porque maximiza la diversidad en la secuencia codificante de estos genes. Los pacientes con mutaciones en los genes NHEJ no pueden producir células B y T funcionales y sufren inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
Los telómeros normalmente están protegidos por una "capa" que evita que se los reconozca como roturas de doble cadena. La pérdida de las proteínas que las protegen provoca el acortamiento de los telómeros y la unión inadecuada por parte de la unión NHEJ, lo que produce cromosomas dicéntricos que luego se separan durante la mitosis. Paradójicamente, algunas proteínas NHEJ están involucradas en la protección de los telómeros. Por ejemplo, Ku se localiza en los telómeros y su eliminación conduce a telómeros acortados. [37] Ku también es necesaria para el silenciamiento subtelomérico, el proceso por el cual se desactivan los genes ubicados cerca de los telómeros.
Varios síndromes humanos están asociados con NHEJ disfuncional. [38] Las mutaciones hipomórficas en LIG4 y XLF causan el síndrome LIG4 y XLF-SCID, respectivamente. Estos síndromes comparten muchas características, incluyendo radiosensibilidad celular, microcefalia e inmunodeficiencia combinada grave (SCID) debido a la recombinación V(D)J defectuosa . Las mutaciones de pérdida de función en Artemis también causan SCID, pero estos pacientes no muestran los defectos neurológicos asociados con las mutaciones LIG4 o XLF. La diferencia en la gravedad puede explicarse por las funciones de las proteínas mutadas. Artemis es una nucleasa y se cree que es necesaria solo para la reparación de DSB con extremos dañados, mientras que la ADN Ligasa IV y XLF son necesarias para todos los eventos NHEJ. Las mutaciones en genes que participan en la unión de extremos no homólogos conducen a ataxia-telangiectasia (gen ATM), anemia de Fanconi (múltiples genes), así como cánceres hereditarios de mama y ovario (gen BRCA1).
Muchos genes NHEJ han sido eliminados en ratones . La eliminación de XRCC4 o LIG4 causa letalidad embrionaria en ratones, lo que indica que NHEJ es esencial para la viabilidad en mamíferos. Por el contrario, los ratones que carecen de Ku o DNA-PKcs son viables, probablemente porque aún pueden ocurrir niveles bajos de unión de extremos en ausencia de estos componentes. [39] Todos los ratones mutantes NHEJ muestran un fenotipo SCID, sensibilidad a la radiación ionizante y apoptosis neuronal.
Se desarrolló un sistema para medir la eficiencia de NHEJ en el ratón. [40] La eficiencia de NHEJ se pudo comparar en los tejidos del mismo ratón y en ratones de diferentes edades. La eficiencia fue mayor en los fibroblastos de la piel, los pulmones y los riñones, y menor en los fibroblastos del corazón y los astrocitos del cerebro. Además, la eficiencia de NHEJ disminuyó con la edad. La disminución fue de 1,8 a 3,8 veces, según el tejido, en los ratones de 5 meses en comparación con los de 24 meses. La capacidad reducida para NHEJ puede conducir a un aumento en el número de roturas de doble cadena de ADN no reparadas o reparadas de forma defectuosa que luego pueden contribuir al envejecimiento. [41] (Véase también la teoría del envejecimiento por daño del ADN ). Un análisis del nivel de la proteína NHEJ Ku80 en humanos, vacas y ratones indicó que los niveles de Ku80 varían drásticamente entre especies, y que estos niveles están fuertemente correlacionados con la longevidad de las especies. [42]