Las pruebas de toxicidad in vitro son el análisis científico de losefectos tóxicos de las sustancias químicas en bacterias cultivadas o células de mamíferos . [1] Los métodos de prueba in vitro (literalmente 'en vidrio') se emplean principalmente para identificar sustancias químicas potencialmente peligrosas y/o para confirmar la falta de ciertas propiedades tóxicas en las primeras etapas del desarrollo de nuevas sustancias potencialmente útiles, como medicamentos terapéuticos , productos químicos agrícolas y aditivos alimentarios.
Recientemente, agencias gubernamentales clave (por ejemplo, EPA; NIEHS/NTP; FDA) han considerado cuidadosamente los ensayos in vitro para la toxicidad de xenobióticos, con el fin de evaluar mejor los riesgos para los seres humanos. Se están llevando a cabo importantes actividades en el uso de sistemas in vitro para avanzar en la comprensión mecanicista de las actividades tóxicas, y en el uso de células y tejidos humanos para definir los efectos tóxicos específicos para los seres humanos. [2]
La mayoría de los toxicólogos creen que los métodos de prueba de toxicidad in vitro pueden ser más útiles, requerir más tiempo y ser más rentables que los estudios toxicológicos en animales vivos [3] (que se denominan métodos in vivo o "en vida"). Sin embargo, la extrapolación de in vitro a in vivo requiere una consideración cuidadosa y es un área de investigación activa.
Debido a las limitaciones regulatorias y a consideraciones éticas, la búsqueda de alternativas a las pruebas con animales ha cobrado un nuevo impulso. En muchos casos, las pruebas in vitro son mejores que las pruebas con animales porque pueden utilizarse para desarrollar productos más seguros. [4]
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos estudió 1.065 sustancias químicas y medicamentos en su programa ToxCast (parte del Panel de Control de Sustancias Químicas CompTox ) utilizando modelos in sílice y un ensayo basado en células madre pluripotentes humanas para predecir intoxicantes del desarrollo in vivo basándose en cambios en el metabolismo celular después de la exposición a sustancias químicas. Los principales hallazgos del análisis de este conjunto de datos ToxCast_STM publicado en 2020 incluyen: (1) el 19% de 1065 productos químicos arrojaron una predicción de toxicidad del desarrollo , (2) el rendimiento del ensayo alcanzó una precisión del 79% al 82% con alta especificidad (> 84%) pero una sensibilidad modesta (< 67%) en comparación con modelos animales in vivo de toxicidad del desarrollo prenatal humano, (3) la sensibilidad mejoró a medida que se aplicaron requisitos de pesos de evidencia más estrictos a los estudios con animales, y (4) el análisis estadístico de los impactos químicos más potentes en objetivos bioquímicos específicos en ToxCast reveló asociaciones positivas y negativas con la respuesta STM, lo que proporciona información sobre los fundamentos mecanísticos del punto final objetivo y su dominio biológico. [5]
Existen muchos métodos de análisis para evaluar la citotoxicidad y otras respuestas celulares de las sustancias de prueba.
El ensayo de hemólisis examina la propensión de sustancias químicas, fármacos o medicamentos , o cualquier dispositivo o material médico que entre en contacto con la sangre, a lisar los glóbulos rojos (eritrocitos). La lisis se detecta fácilmente debido a la liberación de hemoglobina . [6]
El ensayo MTT se utiliza a menudo para determinar la viabilidad celular y ha sido validado para su uso por organizaciones internacionales. El ensayo MTT implica dos pasos: introducir los productos químicos en el ensayo y luego un paso de solubilización.
El ensayo in vitro colorimétrico MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolium) es una versión actualizada del método MTT validado. El ensayo MTS tiene la ventaja de ser soluble, por lo que no requiere ningún paso de solubilización.
El ensayo de ATP tiene la principal ventaja de proporcionar resultados rápidamente (en 15 minutos) y solo requiere menos células de muestra. El ensayo realiza la lisis de las células y la siguiente reacción química entre el ensayo y el contenido de ATP de las células produce luminiscencia. La cantidad de luminiscencia se mide luego con un fotómetro y se puede traducir en número de células vivas desde
Otro parámetro de viabilidad celular puede ser la captación de rojo neutro (NR). El rojo neutro, un colorante catiónico débil, penetra las membranas celulares por no difusión y se acumula en el interior de los lisosomas. Las células viables captan el colorante NR, pero las células dañadas o muertas no.
Los kits ELISA se pueden utilizar para examinar la regulación positiva y negativa de mediadores proinflamatorios como las citocinas (IL-1, TNF alfa, PGE2)....
La medición de este tipo de respuestas celulares puede brindar una ventana a la interacción del artículo de prueba en los modelos de prueba (cultivos celulares en monocapa, modelos de tejido en 3D, explantos de tejido).
En términos generales, existen dos tipos diferentes de estudios in vitro según el tipo de sistema desarrollado para realizar el experimento. Los dos tipos de sistemas que se utilizan generalmente son: a) el sistema de placa de pocillos estáticos y b) los sistemas de perfusión multicompartimental.
Los sistemas de placas o capas de pocillos estáticos son la forma más tradicional y sencilla de análisis que se utiliza ampliamente para el estudio in vitro. Estos análisis son muy beneficiosos, ya que son bastante simples y proporcionan un entorno de análisis muy accesible para controlar las sustancias químicas en el medio de cultivo, así como en la célula. Sin embargo, la desventaja de utilizar estos sencillos análisis de placas de pocillos estáticos es que no pueden representar las interacciones celulares ni las condiciones fisiológicas del flujo de fluidos que tienen lugar dentro del cuerpo.
Actualmente se desarrollan nuevas plataformas de prueba para resolver problemas relacionados con las interacciones celulares. Estas nuevas plataformas son mucho más complejas y se basan en sistemas perfundidos multicompartimentales. [7] El objetivo principal de estos sistemas es reproducir los mecanismos in vivo de manera más confiable al proporcionar un entorno de cultivo celular cercano a la situación in vivo. Cada compartimento del sistema representa un órgano específico del organismo vivo y, por lo tanto, cada compartimento tiene características y criterios específicos. Cada compartimento de estos sistemas está conectado por tubos y bombas a través de los cuales fluye el fluido, imitando así el flujo sanguíneo en la situación in vivo. La desventaja detrás del uso de estos sistemas perfundidos es que los efectos adversos (influencia de los componentes biológicos y no biológicos del sistema en el destino del químico en estudio) son mayores en comparación con los sistemas estáticos. Para reducir el efecto de los componentes no biológicos del sistema, todos los compartimentos están hechos de vidrio y los tubos de conexión están hechos de teflón. Se han propuesto varios modelos cinéticos para ocuparse de estas uniones no específicas que tienen lugar en estos sistemas in vitro. [8]
Para mejorar las dificultades biológicas que surgen del uso de diferentes condiciones de cultivo in vitro, es necesario modificar los modelos tradicionales utilizados en matraces o placas de micropocillos. Con el desarrollo paralelo de las microtecnologías y la ingeniería de tejidos, estos problemas se resuelven utilizando nuevas herramientas pertinentes denominadas "biochips microfluídicos". [9]