La secuenciación de Polony es una técnica de secuenciación multiplex económica pero de gran precisión que se puede utilizar para "leer" millones de secuencias de ADN inmovilizadas en paralelo. Esta técnica fue desarrollada por primera vez por el grupo del Dr. George Church en la Facultad de Medicina de Harvard . A diferencia de otras técnicas de secuenciación, la tecnología de secuenciación de Polony es una plataforma abierta con software y protocolos de código abierto que se pueden descargar libremente. Además, el hardware de esta técnica se puede configurar fácilmente con un microscopio de epifluorescencia comúnmente disponible y un sistema de celda de flujo/fluídica controlado por computadora. La secuenciación de Polony generalmente se realiza en una biblioteca de etiquetas de extremos emparejados en la que cada molécula de plantilla de ADN tiene una longitud de 135 pb con dos etiquetas genómicas emparejadas de 17 a 18 pb separadas y flanqueadas por secuencias comunes. La longitud de lectura actual de esta técnica es de 26 bases por amplicón y 13 bases por etiqueta, dejando un espacio de 4 a 5 bases en cada etiqueta.
El protocolo de secuenciación de Polony se puede dividir en tres partes principales, que son la construcción de la biblioteca de etiquetas finales pareadas, la amplificación de la plantilla y la secuenciación de ADN.
Este protocolo comienza cortando aleatoriamente el ADN genómico probado en una distribución de tamaño ajustada. Las moléculas de ADN cortadas se someten luego a la reparación de extremos y al tratamiento de cola A. El tratamiento de reparación de extremos convierte cualquier extremo saliente dañado o incompatible del ADN en ADN 5'-fosforilado y con extremos romos, lo que permite la ligadura inmediata de extremos romos, mientras que el tratamiento de cola A agrega una A al extremo 3' del ADN cortado. Las moléculas de ADN con una longitud de 1 kb se seleccionan cargándolas en el gel PAGE con TBE al 6%. En el siguiente paso, las moléculas de ADN se circularizan con oligonucleótidos sintéticos de 30 pb de longitud con cola T (T30), que contienen dos sitios de reconocimiento MmeI orientados hacia afuera, y el ADN circularizado resultante se somete a una replicación de círculo rodante . Las moléculas de ADN circularizadas amplificadas se digieren luego con MmeI (endonucleasa de restricción de tipo II) que corta a distancia de su sitio de reconocimiento, liberando el fragmento T30 flanqueado por etiquetas de 17-18 pb (≈70 pb de longitud). Las moléculas de etiqueta pareada deben repararse en los extremos antes de la ligadura de los oligonucleótidos cebadores de ePCR (PCR en emulsión) (FDV2 y RDV2) a sus dos extremos. Las moléculas de la biblioteca de 135 pb resultantes se seleccionan por tamaño y se traducen por mella . Por último, se amplifican las moléculas de la biblioteca de etiqueta final pareada de 135 pb con PCR para aumentar la cantidad de material de la biblioteca y eliminar productos de ligadura extraños en un solo paso. La plantilla de ADN resultante consta de una secuencia FDV de 44 pb, una etiqueta proximal de 17-18 pb, la secuencia T30, una etiqueta distal de 17-18 pb y una secuencia RDV de 25 pb.
Las perlas recubiertas de estreptavidina paramagnéticas de tamaño mono están precargadas con un cebador directo de biotina doble. La estreptavidina tiene una afinidad muy fuerte por la biotina , por lo que el cebador directo se unirá firmemente a la superficie de las perlas. A continuación, se prepara una fase acuosa con las perlas precargadas, la mezcla de PCR, los cebadores directo e inverso y la biblioteca de etiquetas terminales emparejadas. Esto se mezcla y se agita con una fase oleosa para crear la emulsión. Idealmente, cada gota de agua en la emulsión oleosa tiene una perla y una molécula de ADN molde, lo que permite millones de amplificaciones sin interacción dentro de un volumen a escala de mililitros al realizar la PCR.
Después de la amplificación, la emulsión del paso anterior se rompe utilizando isopropanol y tampón de detergente (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 % (v/v) Triton X‐100, 1 % (p/v) SDS), seguido de una serie de agitación con vórtex, centrifugación y separación magnética. La solución resultante es una suspensión de perlas vacías, clonales y no clonales, que surgen de gotitas de emulsión que inicialmente tienen cero, una o múltiples moléculas de plantilla de ADN, respectivamente. La perla amplificada se puede enriquecer en el siguiente paso.
El enriquecimiento de las perlas amplificadas se logra mediante la hibridación con perlas de poliestireno no magnéticas de mayor tamaño y baja densidad que se cargan previamente con oligonucleótidos de captura biotinilados (secuencia de ADN complementaria a la secuencia del amplicón de ePCR). A continuación, la mezcla se centrifuga para separar el complejo de perlas de captura y amplificadas de las perlas no amplificadas. El complejo de perlas de captura y amplificadas tiene una densidad menor y, por lo tanto, permanecerá en el sobrenadante, mientras que las perlas no amplificadas forman un sedimento. El sobrenadante se recupera y se trata con NaOH, que romperá el complejo. Las perlas amplificadas paramagnéticas se separan de las perlas de captura no magnéticas mediante separación magnética. Este protocolo de enriquecimiento es capaz de enriquecer cinco veces las perlas amplificadas.
El objetivo de la protección con microesferas es unir un oligonucleótido de protección al extremo 3' de ambos cebadores de ePCR directos no extendidos y al segmento RDV del ADN molde. La protección que se utiliza es un grupo amino que evita que las sondas fluorescentes se unan a estos extremos y, al mismo tiempo, ayuda al acoplamiento posterior del ADN molde al cubreobjetos de celda de flujo aminosilado.
En primer lugar, se lavan los cubreobjetos y se tratan con aminosilano, lo que permite el acoplamiento covalente posterior del ADN molde sobre ellos y elimina cualquier contaminación fluorescente. Las perlas amplificadas y enriquecidas se mezclan con acrilamida y se vierten en un molde poco profundo formado por un portaobjetos de microscopio enmascarado con teflón . Inmediatamente, se coloca el cubreobjetos tratado con aminosilano sobre el gel de acrilamida y se deja polimerizar durante 45 minutos. A continuación, se invierte la pila de portaobjetos y cubreobjetos y se retira el portaobjetos del gel. Los cubreobjetos tratados con silano se unirán covalentemente al gel, mientras que el teflón en la superficie del portaobjetos del microscopio permitirá una mejor extracción del portaobjetos del gel de acrilamida. A continuación, los cubreobjetos se unirán al cuerpo de la celda de flujo y se eliminarán las perlas sueltas.
La bioquímica de la secuenciación de Polony se basa principalmente en las capacidades discriminatorias de las ligasas y polimerasas. En primer lugar, se hace pasar una serie de cebadores de anclaje a través de las células y se hibridan con las secuencias de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 3' o 5' inmediato de las etiquetas de ADN genómico proximal o distal de 17-18 pb. A continuación, se realiza una reacción de ligación enzimática del cebador de anclaje con una población de nonámeros degenerados que están marcados con colorantes fluorescentes.
Nonámeros marcados diferencialmente:
5' Cy5‐NNNNNNNNT
5' Cy3‐NNNNNNNNA
5' TexasRed‐NNNNNNNNC
5' 6FAM‐NNNNNNNNG
Los nonámeros marcados con fluoróforo se unen con éxito diferencial a las secuencias de la etiqueta de acuerdo con una estrategia similar a la de los cebadores degenerados , pero en lugar de someterse a polimerasas, los nonámeros se ligan selectivamente al ADN adyacente: el cebador de anclaje. La fijación de la molécula de fluoróforo proporciona una señal fluorescente que indica si hay una A, C, G o T en la posición de consulta en la etiqueta de ADN genómico. Después de la obtención de imágenes de cuatro colores, los complejos de cebador de anclaje/nonámero se eliminan y se inicia un nuevo ciclo reemplazando el cebador de anclaje. Se introduce una nueva mezcla de los nonámeros marcados con fluorescencia, para lo cual la posición de consulta se desplaza una base más hacia el interior de la etiqueta de ADN genómico.
5' Cy5‐NNNNNNNTN
5' Cy3‐NNNNNNNAN
5' TexasRed‐NNNNNNNCN
5' 6FAM‐NNNNNNNGN
De esta manera, se pueden consultar siete bases desde la dirección 5' a 3' y seis bases desde el extremo 3'. El resultado final es una longitud de lectura de 26 bases por ejecución (13 bases de cada una de las etiquetas emparejadas) con un espacio de 4 a 5 bases en el medio de cada etiqueta.
La secuenciación de polonia genera millones de 26 lecturas por ejecución y esta información debe normalizarse y convertirse en secuencia. Esto se puede hacer mediante el software desarrollado por Church Lab. Todo el software es gratuito y se puede descargar desde el sitio web. [1]
El instrumento de secuenciación utilizado en esta técnica podría configurarse con el microscopio de fluorescencia disponible comúnmente y una celda de flujo controlada por computadora. Los instrumentos necesarios costaron alrededor de US$130.000 en 2005. [ cita requerida ] En 2009, Dover desarrolló una máquina de secuenciación de polonia dedicada, Polonator , que se vendió por US$170.000 . [2] [3] Presentaba software, reactivos y protocolos de código abierto y estaba destinada a usarse en el Proyecto Genoma Personal . [4]
La secuenciación polonía permite un alto rendimiento y una alta precisión de consenso en la secuenciación de ADN basada en un instrumento de bajo costo y comúnmente disponible. Además, es una técnica muy flexible que permite una aplicación variable, incluida la resecuenciación del genoma bacteriano y del cromosoma artificial bacteriano ( BAC ), así como la secuenciación de etiquetas y códigos de barras SAGE (análisis en serie de la expresión génica). Además, la técnica de secuenciación polonía se destaca como un sistema abierto que comparte todo, incluido el software que se ha desarrollado, el protocolo y los reactivos.
Sin embargo, aunque la adquisición de datos brutos puede alcanzar hasta 786 gigabits, solo 1 bit de información de cada 10 000 bits recopilados es útil. Otro desafío de esta técnica es la uniformidad de la amplificación relativa de los objetivos individuales. La amplificación no uniforme podría reducir la eficiencia de la secuenciación y se presenta como el mayor obstáculo en esta técnica.
La secuenciación de polonias es un desarrollo de la tecnología de polonias de finales de los años 1990 y 2000. [5] Se desarrollaron métodos en 2003 para secuenciar polonias in situ utilizando extensión de base única que podría lograr lecturas de 5-6 bases. [6] Para 2005, estos primeros intentos habían sido revisados para desarrollar la tecnología de secuenciación de polonias existente. [7] Los conceptos de secuenciación por ligación altamente paralela de la secuenciación de polonias han contribuido a la base para tecnologías de secuenciación posteriores como ABI Solid Sequencing .