"Estructura cristalina anotada del LacI dimérico ". Dos monómeros (de cuatro en total) cooperan para unirse a cada secuencia operadora de ADN. Los monómeros (rojo y azul) contienen dominios centrales y de unión al ADN (marcados) que están conectados por un conector (marcado). No se muestra la hélice de tetramerización C-terminal. El represor se muestra en complejo con el operador ADN (oro) y ONPF (verde), un ligando antiinductor ( es decir, un estabilizador de la unión del ADN).
El represor lac (LacI) es una proteína de unión al ADN que inhibe la expresión de genes que codifican proteínas implicadas en el metabolismo de la lactosa en las bacterias. Estos genes se reprimen cuando la lactosa no está disponible para la célula, lo que garantiza que la bacteria solo invierta energía en la producción de la maquinaria necesaria para la absorción y utilización de la lactosa cuando la lactosa está presente. Cuando la lactosa está disponible, primero la β-galactosidasa ( lacZ ) la convierte en alolactosa en las bacterias. La capacidad de unión al ADN del represor lac unido a la alolactosa se inhibe debido a la regulación alostérica , por lo que se pueden expresar genes que codifican proteínas implicadas en la captación y utilización de la lactosa.
Función
El represor lac (LacI) opera mediante un motivo de hélice-giro-hélice en su dominio de unión al ADN , uniéndose específicamente a la base al surco principal de la región operadora del operón lac , con contactos de base también realizados por residuos de elementos relacionados con la simetría. hélices alfa, las hélices "bisagra", que se unen profundamente en el surco menor. [1] Este represor unido puede reducir la transcripción de las proteínas Lac al ocluir el sitio de unión de la ARN polimerasa o al provocar un bucle de ADN. [2] Cuando hay lactosa presente, la alolactosa se une al represor lac , provocando un cambio alostérico en su forma. En su estado modificado, el represor lac no puede unirse firmemente a su operador afín. Por lo tanto, el gen está mayoritariamente desactivado en ausencia de un inductor y mayormente activado en presencia de un inductor, aunque el grado de expresión genética depende del número de represores en la célula y de la afinidad de unión al ADN del represor. [3] El isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) es un imitador de alolactosa de uso común que puede usarse para inducir la transcripción de genes que están regulados por el represor lac .
Estructura
LacI tetramérico se une a dos secuencias operadoras e induce bucles de ADN. Dos subunidades funcionales diméricas de LacI (rojo+azul y verde+naranja) se unen cada una a una secuencia operadora de ADN (etiquetada). Estas dos subunidades funcionales están acopladas en la región de tetramerización (marcadas); por tanto, LacI tetramérico se une a dos secuencias operadoras. Esto permite que LacI tetramérico induzca bucles de ADN.
Estructuralmente, la proteína represora lac es un homotetrámero . Más precisamente, el tetrámero contiene dos subunidades de unión al ADN compuestas por dos monómeros cada una (un dímero de dímeros). Cada monómero consta de cuatro regiones distintas: [4] [5] [6]
Un dominio de unión al ADN N-terminal (en el que dos proteínas LacI se unen a un único sitio operador)
Un dominio regulador (a veces llamado dominio central , que se une a la alolactosa, una molécula efectora alostérica)
Un conector que conecta el dominio de unión al ADN con el dominio central (a veces llamado hélice bisagra , que es importante para la comunicación alostérica [6] )
Una región de tetramerización C-terminal (que une cuatro monómeros en un haz de hélice alfa)
La unión al ADN se produce a través de un motivo estructural de hélice-giro-hélice N-terminal y está dirigido a una de varias secuencias de ADN operadoras (conocidas como O 1 , O 2 y O 3 ). La secuencia del operador O 1 se superpone ligeramente con el promotor, lo que aumenta la afinidad de la ARN polimerasa por la secuencia del promotor de modo que no puede entrar en elongación y permanece en iniciación abortiva . Además, debido a que cada tetrámero contiene dos subunidades de unión al ADN, la unión de múltiples secuencias operadoras por un solo tetrámero induce la formación de bucles en el ADN. [7]
Cinética de unión y desunión del ADN.
Animación del mecanismo de unión y desunión de un dímero LacI y su sitio de ADN objetivo.
LacI encuentra el ADN de su operador objetivo sorprendentemente rápido. In vitro, la búsqueda es entre 10 y 100 veces más rápida que el límite superior teórico para dos partículas que se buscan entre sí mediante difusión en tres dimensiones (3D). [8] Para explicar la búsqueda rápida, se planteó la hipótesis de que LacI y otros factores de transcripción (TF) encuentran sus sitios de unión mediante difusión facilitada, una combinación de difusión libre en 3D y deslizamiento 1D en el ADN. [9] Durante el deslizamiento, el represor está en contacto con la hélice del ADN, deslizándose y siguiendo su surco principal, lo que acelera el proceso de búsqueda al extender la longitud del objetivo cuando el TF se desliza hacia el operador desde un lado. Los experimentos in vivo de una sola molécula con células de E. coli ahora han probado y verificado el modelo de difusión facilitada y han demostrado que el TF escanea un promedio de 45 pb durante cada evento de deslizamiento, antes de que el TF se desprenda espontáneamente y reanude la exploración del genoma en 3D. [10] Estos experimentos también sugieren que LacI se desliza sobre el operador O 1 varias veces antes de unirse, lo que significa que diferentes secuencias de ADN pueden tener diferentes probabilidades de ser reconocidas en cada encuentro con el TF. Esto implica un equilibrio entre la búsqueda rápida de secuencias no específicas y la unión a secuencias específicas. [10] Experimentos in vivo e in vitro han demostrado que es esta probabilidad de reconocer el operador la que cambia con la secuencia de ADN, mientras que el tiempo que el TF permanece en la conformación unida en el operador cambia menos con la secuencia. [11] El TF a menudo abandona la secuencia que pretende regular, pero en un sitio objetivo fuerte, casi siempre hace un viaje muy corto antes de encontrar el camino de regreso. A escala macroscópica, esto parece una interacción estable. Este mecanismo de unión explica cómo las proteínas de unión al ADN logran buscar rápidamente en el genoma de la célula sin quedarse demasiado tiempo atascadas en secuencias que se parecen al verdadero objetivo.
Una simulación de dinámica molecular de todos los átomos sugiere que el factor de transcripción encuentra una barrera de 1 k B T durante el deslizamiento y 12 k B T para la disociación, lo que implica que el represor se deslizará más de 8 pb en promedio antes de disociarse. [12] El modelo de búsqueda in vivo del represor lac incluye transferencia y salto entre segmentos, así como apiñamiento por otras proteínas que hacen que el genoma de las células de E. coli sea menos accesible para el represor. [13] La existencia de salto, donde la proteína se desliza fuera del surco principal del ADN para aterrizar en otro surco cercano a lo largo de la cadena de ADN, se ha demostrado más directamente in vitro , donde se ha observado que el represor lac evita a los operadores, voltear. orientación y gira con un paso más largo que el período de 10,5 pb del ADN mientras se mueve a lo largo de él. [14]
Descubrimiento
El represor lac fue aislado por primera vez por Walter Gilbert y Benno Müller-Hill en 1966. [15] Demostraron que in vitro la proteína se unía al ADN que contenía el operón lac y liberaba el ADN cuando se agregaba IPTG (un análogo de la alolactosa). .
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