La radiactividad se utiliza generalmente en las ciencias de la vida para realizar mediciones muy sensibles y directas de fenómenos biológicos y para visualizar la ubicación de biomoléculas radiomarcadas con un radioisótopo .
Todos los átomos existen como isótopos estables o inestables y estos últimos se desintegran en una vida media determinada que va desde attosegundos hasta miles de millones de años; los radioisótopos útiles para sistemas biológicos y experimentales tienen vidas medias que van desde minutos hasta meses. En el caso del isótopo de hidrógeno tritio (vida media = 12,3 años) y carbono-14 (vida media = 5.730 años), estos isótopos derivan su importancia de toda la vida orgánica que contiene hidrógeno y carbono y, por lo tanto, pueden usarse para estudiar innumerables procesos, reacciones y fenómenos vivos. La mayoría de los isótopos de vida corta se producen en ciclotrones , aceleradores lineales de partículas o reactores nucleares y sus vidas medias relativamente cortas les dan altas actividades específicas teóricas máximas que son útiles para la detección en sistemas biológicos.
El radiomarcaje es una técnica utilizada para rastrear el paso de una molécula que incorpora un radioisótopo a través de una reacción, vía metabólica, célula, tejido, organismo o sistema biológico. El reactivo se "marca" reemplazando átomos específicos por su isótopo. Reemplazar un átomo con su propio radioisótopo es una etiqueta intrínseca que no altera la estructura de la molécula. Alternativamente, las moléculas pueden ser radiomarcadas por reacciones químicas que introducen un átomo, fracción o grupo funcional que contiene un radionúclido . Por ejemplo, la radioyodación de péptidos y proteínas con isótopos de yodo biológicamente útiles se realiza fácilmente mediante una reacción de oxidación que reemplaza el grupo hidroxilo con yodo en residuos de tirosina e histadina . Otro ejemplo es usar quelantes como DOTA que se pueden acoplar químicamente a una proteína; el quelante a su vez atrapa radiometales radiomarcando así la proteína. Esto se ha utilizado para introducir itrio-90 en un anticuerpo monoclonal con fines terapéuticos y para introducir galio-68 en el péptido octreotida para diagnóstico por imágenes mediante PET . [1] (Ver usos de DOTA ).
El radiomarcaje no es necesario para algunas aplicaciones. Para algunos propósitos, las sales iónicas solubles se pueden utilizar directamente sin modificaciones adicionales (por ejemplo, los isótopos de galio-67 , galio-68 y yodo radiactivo ). Estos usos dependen de las propiedades químicas y biológicas del propio radioisótopo, para localizarlo dentro del organismo o sistema biológico.
La obtención de imágenes moleculares es el campo biomédico que emplea radiotrazadores para visualizar y cuantificar procesos biológicos mediante tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía computarizada por emisión monofotónica (SPECT). Una vez más, una característica clave del uso de la radiactividad en aplicaciones de ciencias biológicas es que se trata de una técnica cuantitativa, por lo que la PET/SPECT no solo revela dónde se encuentra una molécula radiomarcada, sino también cuánta hay.
La radiobiología (también conocida como biología de la radiación) es un campo de las ciencias médicas básicas y clínicas que se ocupa del estudio de la acción de la radiactividad sobre los sistemas biológicos. La acción controlada de la radiactividad nociva sobre los sistemas vivos es la base de la radioterapia .
El tritio (hidrógeno-3) es un emisor de energía beta muy bajo que se puede utilizar para etiquetar proteínas , ácidos nucleicos , fármacos y casi cualquier biomolécula orgánica. La actividad específica teórica máxima del tritio es de 28,8 kCi / mol (1.070 TBq /mol). [2] Sin embargo, a menudo hay más de un átomo de tritio por molécula: por ejemplo, la mayoría de los proveedores venden UTP tritiado con los carbonos 5 y 6 cada uno unido a un átomo de tritio.
Para la detección de tritio, se han empleado clásicamente contadores de centelleo líquido, en los que la energía de una desintegración de tritio se transfiere a una molécula centelleante en solución que, a su vez, emite fotones cuya intensidad y espectro se pueden medir mediante un conjunto de fotomultiplicadores . La eficiencia de este proceso es del 4 al 50 %, dependiendo del cóctel de centelleo utilizado. [3] [4] Las mediciones se expresan normalmente en cuentas por minuto (CPM) o desintegraciones por minuto (DPM). Alternativamente, se puede utilizar una pantalla de fósforo de estado sólido específica para tritio junto con un generador de imágenes de fósforo para medir y obtener imágenes del radiotrazador simultáneamente. [5] Las mediciones/imágenes son de naturaleza digital y se pueden expresar en unidades de intensidad o densitometría dentro de una región de interés (ROI).
El carbono-14 tiene una vida media larga.5730 ± 40 años . Su actividad específica máxima es de 0,0624 kCi/mol (2,31 TBq/mol). Se utiliza en aplicaciones como la datación radiométrica o las pruebas de fármacos. [6] El marcaje con carbono-14 es común en el desarrollo de fármacos para realizar estudios ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) en modelos animales y en toxicología humana y ensayos clínicos. Dado que el intercambio de tritio puede ocurrir en algunos compuestos radiomarcados, esto no sucede con el carbono-14 y, por lo tanto, puede ser preferible.
El sodio-22 y el cloro-36 se utilizan habitualmente para estudiar los transportadores de iones . Sin embargo, el sodio-22 es difícil de eliminar y el cloro-36, con una vida media de 300.000 años, tiene una actividad baja. [7]
El azufre-35 se utiliza para marcar proteínas y ácidos nucleicos. La cisteína es un aminoácido que contiene un grupo tiol que puede marcarse con azufre-35. En el caso de los nucleótidos que no contienen un grupo azufre, el oxígeno de uno de los grupos fosfato puede sustituirse por un azufre. Este tiofosfato actúa igual que un grupo fosfato normal, aunque la mayoría de las polimerasas lo rechazan ligeramente . La actividad específica teórica máxima es de 1.494 kCi/mol (55,3 PBq/mol).
El fósforo-32 se utiliza ampliamente para etiquetar ácidos nucleicos y fosfoproteínas. Tiene la energía de emisión más alta (1,7 MeV) de todos los radioisótopos de investigación comunes. Esta es una ventaja importante en experimentos para los que la sensibilidad es una consideración principal, como titulaciones de interacciones muy fuertes ( es decir , constante de disociación muy baja ), experimentos de huella y detección de especies fosforiladas de baja abundancia. El fósforo-32 también es relativamente económico. Sin embargo, debido a su alta energía, su uso seguro requiere una serie de controles de ingeniería ( por ejemplo , vidrio acrílico ) y controles administrativos . La vida media del fósforo-32 es de 14,2 días y su actividad específica máxima es de 9131 kCi/mol (337,8 PBq/mol).
El fósforo-33 se utiliza para marcar nucleótidos. Es menos energético que el fósforo-32 y no requiere protección con plexiglás . Una desventaja es su mayor coste en comparación con el fósforo-32, ya que la mayoría del fósforo-31 bombardeado habrá adquirido solo un neutrón , mientras que solo algunos habrán adquirido dos o más. Su actividad específica máxima es de 5.118 kCi/mol (189,4 PBq/mol).
El yodo-125 se utiliza habitualmente para marcar proteínas, normalmente en residuos de tirosina. El yodo no unido es volátil y debe manipularse en una campana extractora. Su actividad específica máxima es de 2176 kCi/mol (80,5 PBq/mol).
Un buen ejemplo de la diferencia de energía entre los distintos radionúcleos son los rangos de la ventana de detección utilizados para detectarlos, que generalmente son proporcionales a la energía de la emisión, pero varían de una máquina a otra: en un contador de centelleo Perkin Elmer TriLux Beta, la ventana de rango de energía del hidrógeno-3 está entre el canal 5-360; el carbono-14, el azufre-35 y el fósforo-33 están en la ventana de 361-660; y el fósforo-32 está en la ventana de 661-1024. [ cita requerida ]
En el recuento por centelleo líquido , se añade una pequeña alícuota, un filtro o un hisopo al líquido de centelleo y la placa o el vial se coloca en un contador de centelleo para medir las emisiones radiactivas. Los fabricantes han incorporado centelleantes sólidos en placas de múltiples pocillos para eliminar la necesidad de líquido de centelleo y convertirla en una técnica de alto rendimiento.
Un contador gamma es similar en formato al conteo de centelleo, pero detecta emisiones gamma directamente y no requiere un centelleante.
Un contador Geiger es una aproximación rápida y aproximada de la actividad. No se pueden detectar emisores de energía más baja, como el tritio.
Autorradiografía : una sección de tejido adherida a un portaobjetos de microscopio o a una membrana, como una transferencia Northern o una transferencia de ranura hibridada , se puede colocar contra una película de rayos X o pantallas de fósforo para obtener una imagen fotográfica o digital. La densidad de exposición, si se calibra, puede proporcionar información cuantitativa precisa.
Pantalla de almacenamiento de fósforo : la lámina o membrana se coloca contra una pantalla de fósforo que luego se escanea en un generador de imágenes por fósforo . Esto es mucho más rápido que las técnicas de película/emulsión y genera datos en formato digital, por lo que ha reemplazado en gran medida a las técnicas de película/emulsión.
Microscopía electrónica : la muestra no se expone a un haz de electrones, sino que los detectores captan los electrones expulsados de los radionúcleos.
Microautorradiografía: una sección de tejido, normalmente crioseccionada, se coloca contra una pantalla de fósforo como se muestra arriba.
Autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero (QWBA): de mayor tamaño que la microautorradiografía, se pueden analizar animales enteros, generalmente roedores, para estudios de biodistribución.
La regresión de Schild es un ensayo de unión de radioligandos. Se utiliza para el marcaje del ADN (5' y 3'), dejando intactos los ácidos nucleicos.
Un vial de radiofármaco tiene una "actividad total". Si tomamos como ejemplo el γ32P ATP , de los catálogos de los dos principales proveedores, Perkin Elmer NEG502H500UC o GE AA0068-500UCI, en este caso, la actividad total es de 500 μCi (otros números típicos son 250 μCi o 1 mCi). Esto está contenido en un cierto volumen, dependiendo de la concentración radiactiva, como por ejemplo de 5 a 10 mCi/mL (185 a 370 TBq/m 3 ); los volúmenes típicos incluyen 50 o 25 μL.
No todas las moléculas de la solución tienen un P-32 en el último fosfato (es decir, gamma): la "actividad específica" proporciona la concentración de radiactividad y depende de la vida media de los radionúcleos. Si se etiquetaran todas las moléculas, se obtendría una actividad específica teórica máxima para el P-32 de 9131 Ci/mmol. Debido a problemas de precalibración y eficiencia, este número nunca aparece en la etiqueta; los valores que se encuentran a menudo son 800, 3000 y 6000 Ci/mmol. Con este número es posible calcular la concentración química total y la relación entre caliente y frío.
La "fecha de calibración" es la fecha en la que la actividad del vial es la misma que la que figura en la etiqueta. La "precalibración" es cuando la actividad se calibra en una fecha futura para compensar la descomposición ocurrida durante el envío.
Antes del uso generalizado de la fluorescencia en las últimas tres décadas, la radiactividad era la etiqueta más común.
La principal ventaja de la fluorescencia frente a los radiotrazadores es que no requiere controles radiológicos y los gastos y medidas de seguridad asociados. La desintegración de los radioisótopos puede limitar la vida útil de un reactivo, obligando a su sustitución y aumentando así los gastos. Se pueden utilizar varias moléculas fluorescentes simultáneamente (siempre que no se superpongan, cf. FRET), mientras que con la radiactividad se pueden utilizar dos isótopos (tritio y un isótopo de baja energía, p. ej. 33 P debido a las diferentes intensidades) pero se requiere un equipo especial (una pantalla de tritio y una pantalla de formación de imágenes de fósforo normal, un detector de doble canal específico, p. ej. [1]).
La fluorescencia no es necesariamente más fácil ni más cómoda de utilizar porque requiere un equipo especializado propio y porque la extinción dificulta la cuantificación absoluta y/o reproducible.
La principal desventaja de la fluorescencia frente a los radiotrazadores es un problema biológico importante: el marcado químico de una molécula con un colorante fluorescente cambia radicalmente la estructura de la molécula, lo que a su vez puede cambiar radicalmente la forma en que la molécula interactúa con otras moléculas. En cambio, el radiomarcado intrínseco de una molécula se puede realizar sin alterar su estructura de ninguna manera. Por ejemplo, sustituir un átomo de hidrógeno por un H-3 o un átomo de carbono por un C-14 no cambia la conformación, la estructura ni ninguna otra propiedad de la molécula, solo se cambian las formas del mismo átomo. Por lo tanto, una molécula intrínsecamente radiomarcada es idéntica a su contraparte no marcada.
La medición de fenómenos biológicos mediante radiotrazadores siempre es directa. Por el contrario, muchas aplicaciones de fluorescencia en ciencias de la vida son indirectas y consisten en que un colorante fluorescente aumenta, disminuye o cambia su longitud de onda de emisión al unirse a la molécula de interés.
Si se mantienen buenos controles de física de la salud en un laboratorio donde se utilizan radionucleidos, es poco probable que la dosis total de radiación recibida por los trabajadores sea de mucha importancia. Sin embargo, los efectos de las dosis bajas son en su mayoría desconocidos, por lo que existen muchas regulaciones para evitar riesgos innecesarios, como la exposición cutánea o interna. Debido al bajo poder de penetración y a las muchas variables involucradas, es difícil convertir una concentración radiactiva en una dosis. 1 μCi de P-32 en un centímetro cuadrado de piel (a través de una capa muerta de un espesor de 70 μm) da 7961 rads (79,61 grays ) por hora. De manera similar, una mamografía da una exposición de 300 mrem (3 mSv ) en un volumen mayor (en los EE. UU., la dosis anual promedio es de 620 mrem o 6,2 mSv [8] ).
Archivo de datos 29-0262-96 AA
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