La timidilato sintasa (TS) ( EC 2.1.1.45) [5] es una enzima que cataliza la conversión de monofosfato de desoxiuridina (dUMP) a monofosfato de desoxitimidina (dTMP). La timidina es uno de los nucleótidos del ADN. Con la inhibición de la TS, se produce un desequilibrio de los desoxinucleótidos y un aumento de los niveles de dUMP . Ambos causan daño al ADN. [6] [7]
La siguiente reacción es catalizada por la timidilato sintasa:
Mediante metilación reductora , el monofosfato de desoxiuridina (dUMP) y el N5,N10-metilen tetrahidrofolato se utilizan juntos para formar dTMP, produciendo dihidrofolato como producto secundario.
Esta proporciona la única vía de novo para la producción de dTMP y es la única enzima en el metabolismo del folato en la que el 5,10-metilentetrahidrofolato se oxida durante la transferencia de un carbono. [8] La enzima es esencial para regular el suministro equilibrado de los 4 precursores de ADN en la replicación normal del ADN: los defectos en la actividad enzimática que afectan al proceso de regulación causan varias anomalías biológicas y genéticas, como la muerte sin timina. [9] La enzima es un objetivo importante para ciertos fármacos quimioterapéuticos. La timidilato sintasa es una enzima de aproximadamente 30 a 35 k Da en la mayoría de las especies, excepto en protozoos y plantas, donde existe como una enzima bifuncional que incluye un dominio de dihidrofolato reductasa. [8] Un residuo de cisteína está involucrado en el mecanismo catalítico (se une covalentemente al intermediario 5,6-dihidro-dUMP). La secuencia alrededor del sitio activo de esta enzima se conserva desde los fagos hasta los vertebrados.
La timidilato sintasa es inducida por un factor de transcripción LSF/ TFCP2 y LSF es un oncogén en el carcinoma hepatocelular . LSF y la timidilato sintasa desempeñan un papel importante en la proliferación y progresión del cáncer de hígado y en la resistencia a los fármacos. [10]
La timidilato sintasa (TS) desempeña un papel crucial en las primeras etapas de la biosíntesis del ADN . [11] El daño o la eliminación del ADN ocurren a diario como resultado de factores tanto endógenos como ambientales. Dichos factores ambientales incluyen el daño ultravioleta y el humo del cigarrillo que contienen una variedad de carcinógenos. [12] Por lo tanto, la síntesis e inserción de ADN saludable es vital para las funciones corporales normales y para evitar la actividad cancerosa. Además, la inhibición de la síntesis de nucleótidos importantes necesarios para el crecimiento celular es importante. Por esta razón, la TS se ha convertido en un objetivo importante para el tratamiento del cáncer mediante quimioterapia . La sensibilidad de la TS a sucumbir a los inhibidores de la TS es una parte clave de su éxito como tratamiento para los cánceres colorrectal, pancreático, ovárico, gástrico y de mama. [11]
El uso de inhibidores de la TS se ha convertido en un objetivo principal para el uso de la TS como diana farmacológica. El inhibidor más utilizado es el 5-fluorouracilo (5-FU) y su forma metabolizada, el monofosfato de 5-fluorodesoxiuridina (5-FdUMP), que actúa como un antimetabolito que inhibe irreversiblemente la TS mediante la unión competitiva. [13] Sin embargo, debido a un bajo nivel de 5-FU encontrado en muchos pacientes, se ha descubierto que en combinación con leucovorina (LV), el 5-FU tiene mayor éxito en la regulación negativa de los mecanismos de progresión tumoral y en el aumento de la actividad del sistema inmunológico. [14]
Experimentalmente, se ha demostrado que los niveles bajos de expresión de TS conducen a una mejor respuesta al 5-FU y mayores tasas de éxito y supervivencia de los pacientes con cáncer de colon y de hígado. [11] Sin embargo, experimentos adicionales simplemente han indicado que los niveles de TS pueden estar asociados con el estadio de la enfermedad, la proliferación celular y la diferenciación tumoral para aquellos con adenocarcinoma de pulmón , pero los niveles bajos no son necesariamente indicadores de alto éxito. Los niveles de expresión de ARNm de TS pueden ser útiles para predecir el potencial maligno de ciertas células cancerosas, mejorando así los objetivos del tratamiento del cáncer y produciendo mayores tasas de supervivencia entre los pacientes con cáncer [Hashimoto].
La relación de la TS con el ciclo celular también contribuye a su uso en el tratamiento del cáncer. Varias quinasas dependientes del ciclo celular y factores de transcripción influyen en los niveles de TS en el ciclo celular que aumentan su actividad durante la fase S pero disminuyen su actividad cuando las células ya no están proliferando. [11] De manera autorregulatoria, la TS no solo controla su propia traducción sino también la de otras proteínas como p53 que a través de la mutación es la raíz de gran parte del crecimiento tumoral. A través de su traducción, la TS tiene una expresión variable en las células cancerosas y los tumores, lo que conduce a la muerte celular temprana. [13]
Haga clic en los genes, proteínas y metabolitos que aparecen a continuación para acceder a los artículos correspondientes. [§ 1]
En el mecanismo propuesto, el TS forma un enlace covalente con el sustrato dUMP a través de una adición 1,4 que involucra un nucleófilo de cisteína. El sustrato tetrahidrofolato dona un grupo metilo al carbono alfa mientras reduce el nuevo metilo en dUMP para formar dTMP. [15]
Se ha demostrado que la imina formada a través de la reacción con THF y dUMP es un intermediario en la reacción con dUMP a través de mutaciones en la estructura de TS que inhiben la finalización del mecanismo. V316Am TS, un mutante con deleción de valinas C-terminales de ambas subunidades, permite la catálisis de la deshalogenación de BrdUMP que precede al mecanismo descrito anteriormente y al enlace covalente a THF y dUMP. El mutante TS es incapaz de lograr el cambio conformacional C-terminal necesario para romper los enlaces covalentes para formar dTMP, demostrando así que el mecanismo propuesto es verdadero. La estructura se dedujo a través de cristalografía de rayos X de V316Am TS para ilustrar la estructura completa del homodímero TS (Figura 1). Además, mostró posibles interacciones de 175Arg y 174Arg entre dímeros. Se cree que estas argininas estabilizan las estructuras de UMP dentro de los sitios activos creando enlaces de hidrógeno con el grupo fosfato (Figura 2). [Stroud y Finer-Moore] [ cita requerida ] El 5-FU es un inhibidor de la TS. Al entrar en la célula, el 5-fluorouracilo (5-FU) se convierte en una variedad de metabolitos activos, intracelularmente. Uno de estos metabolitos es el FdUMP, que se diferencia del dUMP por un flúor en lugar de un hidrógeno en el carbono alfa. El FdUMP es capaz de inhibir la TS uniéndose al sitio de unión del nucleótido del dUMP. Esta unión competitiva inhibe la función normal de la síntesis de dTMP a partir del dUMP [Longley]. [ cita requerida ] Por lo tanto, el dUMP no puede tener una reacción de eliminación y completar la donación de metilo del THF.
Figura 1. Esta figura muestra el homodímero que es TS. Como puede ver, las cadenas principales naranja y verde azulado nunca se conectan ni se entrelazan, pero hay interacciones de cadenas laterales entre los dímeros. En la proteína naranja, puede detectar visiblemente dos cadenas laterales largas que ingresan a la proteína verde azulado (esta se encuentra dentro del círculo amarillo). Las otras partes beige son cadenas laterales que interactúan dentro del sitio activo. Justo debajo del círculo amarillo, puede ver el mismo patrón de cadenas laterales y configuración.
Figura 2. Esta figura muestra las posibles interacciones de enlace de hidrógeno entre las argininas y el UMP en el sitio activo de la timidilato sintasa. Esto se puede ver por las líneas tenues entre las puntas azules y las puntas rojas. Estas argininas se utilizan para mantener la posición de la molécula de UMP de modo que la interacción pueda ocurrir correctamente. Las dos argininas en la esquina superior derecha que se encuentran una al lado de la otra en la estructura principal son en realidad de la otra proteína de esta enzima dimérica. Esta interacción es una de las muchas fuerzas intermoleculares que mantienen unidas estas dos estructuras terciarias. El soporte amarillo en la región superior central muestra un enlace de azufre que se forma entre una cadena lateral de cisteína y el UMP. Esto mantiene covalentemente al UMP dentro del sitio activo hasta que reacciona para producir TMP.
