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Inmunodifusión radial

La inmunodifusión radial (RID), inmunodifusión de Mancini o ensayo de inmunodifusión radial simple, es una técnica de inmunodifusión utilizada en inmunología para determinar la cantidad o concentración de un antígeno en una muestra.

Descripción

Preparación

Se añade una solución que contiene el anticuerpo a un medio calentado, como agar o agarosa disuelta en solución salina normal tamponada . A continuación, el medio fundido se vierte sobre un portaobjetos de microscopio o en un recipiente abierto, como una placa de Petri , y se deja enfriar y formar un gel . A continuación, se coloca una solución que contiene el antígeno en un pocillo que se perfora en el gel. A continuación, el portaobjetos o el recipiente se cubre, se cierra o se coloca en una caja de humedad para evitar la evaporación. [1] [2] [3] [4]

El antígeno se difunde radialmente en el medio, formando un círculo de precipitina que marca el límite entre el anticuerpo y el antígeno. [1] [2] El diámetro del círculo aumenta con el tiempo a medida que el antígeno se difunde en el medio, reacciona con el anticuerpo y forma complejos de precipitina insolubles . [1] [2] [5] El antígeno se cuantifica midiendo el diámetro del círculo de precipitina y comparándolo con los diámetros de los círculos de precipitina formados por cantidades o concentraciones conocidas del antígeno. [1] [2] [3] [6]

Los complejos antígeno-anticuerpo son pequeños y solubles cuando hay un exceso de antígeno. Por lo tanto, la precipitación cerca del centro del círculo suele ser menos densa que cerca del borde exterior del círculo, donde el antígeno está menos concentrado. [1] [2]

La expansión del círculo alcanza un punto final y se detiene cuando se agota el antígeno libre y cuando el antígeno y el anticuerpo alcanzan la equivalencia. [1] [2] [5] Sin embargo, la claridad y la densidad del borde exterior del círculo pueden seguir aumentando después de que el círculo deje de expandirse. [1]

Interpretación

Gráficos de líneas de mejor ajuste. El RID a menudo produce gráficos similares cuando la abscisa horizontal (eje X) contiene las concentraciones iniciales de antígeno, la ordenada vertical (eje Y) contiene los cuadrados de los diámetros de los anillos de precipitina y cada gráfico es un tiempo de medición. El gráfico violeta completamente curvo (abajo) aparece cuando todos los anillos se están expandiendo. El gráfico rojo completamente recto (arriba) aparece cuando todos los anillos han alcanzado sus puntos finales y han dejado de expandirse. Los gráficos intermedios son parcialmente rectos y parcialmente curvados (ver [7] y [8] ).

Para la mayoría de los antígenos, el área y el cuadrado del diámetro del círculo en el punto final del círculo son directamente proporcionales a la cantidad inicial de antígeno y son inversamente proporcionales a la concentración de anticuerpo. [1] [2] [5] Por lo tanto, un gráfico que compara las cantidades o concentraciones de antígeno en las muestras originales con las áreas o los cuadrados de los diámetros de los círculos de precipitina en un gráfico de línea de mejor ajuste generalmente será una línea recta después de que todos los círculos hayan alcanzado sus puntos finales (método de equivalencia). [1] [3] [5] [6]

Los círculos que crean pequeñas cantidades de antígeno alcanzan sus puntos finales antes que los círculos creados por grandes cantidades. [1] [2] [5] Por lo tanto, si se miden las áreas o los diámetros de los círculos mientras algunos, pero no todos, los círculos han dejado de expandirse, dicho gráfico será recto en la parte cuyos pocillos contenían inicialmente las cantidades o concentraciones más pequeñas de antígeno y será curvo en la parte cuyos pocillos contenían las cantidades o concentraciones más grandes. [1] [5]

Mientras los círculos todavía se están expandiendo, un gráfico que compara las cantidades o concentraciones iniciales del antígeno en una escala logarítmica con los diámetros o áreas de los círculos en una escala lineal puede ser una línea recta (método cinético). [1] [2] [4] [5] [6] [9] Sin embargo, los círculos del precipitado son más pequeños y menos distintos durante la expansión que después de que la expansión ha terminado. [1] [5] Además, la temperatura afecta la velocidad de expansión, pero no afecta el tamaño de un círculo en su punto final. [1] Además, el rango de diámetros de círculo para las mismas cantidades o concentraciones iniciales de antígeno es más pequeño mientras algunos círculos se están agrandando que después de que todos los círculos han alcanzado sus puntos finales. [1] [5]

La cantidad y concentración de complejos antígeno-anticuerpo insolubles en el borde exterior del círculo aumentan con el tiempo. [1] Por lo tanto, la claridad y densidad del borde exterior del círculo también aumentan con el tiempo. [1] Como resultado, las mediciones de los tamaños de los círculos y los gráficos producidos a partir de estas mediciones suelen ser más precisos después de que los círculos hayan dejado de expandirse que cuando los círculos aún se están agrandando. [1] Por esas razones, a menudo es más deseable tomar mediciones después de que todos los círculos hayan alcanzado sus puntos finales que tomar mediciones mientras algunos o todos los círculos aún se están agrandando. [1]

Las mediciones de círculos grandes son más precisas que las de círculos pequeños. [1] [10] Por lo tanto, a menudo es deseable ajustar la concentración de anticuerpo y las cantidades iniciales de antígeno para asegurar que los anillos de precipitina sean grandes. [1]

Técnicas de inmunodifusión radial

Línea recta en un gráfico semilogarítmico de mejor ajuste. El método RID a menudo produce un gráfico similar mientras todos los círculos de precipitina se expanden, como en el método cinético (consulte [11] y [12] ).

Se puede determinar la concentración de antígeno en una muestra cuya concentración se desconoce al encontrar su ubicación en un gráfico que representa los diámetros de los círculos de precipitina producidos por tres o más muestras de referencia con concentraciones de antígeno conocidas. Dos técnicas producen a menudo líneas rectas en dichos gráficos. Las técnicas producen esas líneas en diferentes tipos de gráficos.

Las técnicas y sus gráficas son:

Notas

  1. ^ abcdefghijklmnopqrstu Berna (1974).
  2. ^ abcdefghij Davis NC, Ho M (1976). "Capítulo 2: Cuantificación de inmunoglobulinas: inmunodifusión radial". En Rose N, Friedman H (eds.). Manual de inmunología clínica . Washington, DC: Sociedad Estadounidense de Microbiología . pp. 5–8. ISBN 0-914826-09-3. LCCN  76017595. OCLC  1036571523. Consultado el 14 de junio de 2019 a través de Internet Archive .
  3. ^ abcd Stanley (2002)
  4. ^ abc Laboratorio de Microbiología Dental LSUMC/MIP (2002).
  5. ^ abcdefghi Varias fuentes:
    • Mancini G, Carbonara AO, Heremans JF (septiembre de 1965). «Cuantificación inmunoquímica de antígenos mediante inmunodifusión radial simple». Inmunoquímica . 2 (3). Oxford , Inglaterra : Pergamon Press : 235–254. doi :10.1016/0019-2791(65)90004-2. ISSN  0019-2791. LCCN  64009461. OCLC  53097967. PMID  4956917. Archivado desde el original el 2023-12-17 . Consultado el 2023-12-17 – vía Academia.edu .
    • Mancini G, Vaerman JP, Carbonara AO, Heremans JF (diciembre de 1964). "Un método de difusión radial simple para la cuantificación inmunológica de proteínas". En Peeters, Hubert (ed.). Prótidos de los fluidos biológicos: Actas del 11.º Coloquio, Brujas, Bélgica (1963) . Ámsterdam , Países Bajos : Elsevier . págs. 370–373. OCLC  25285708. Consultado el 8 de julio de 2020 a través de Google Books .
  6. ^ abc Parvez Z (1984). "Revisión de técnicas inmunológicas". Inmunoensayos en pruebas de coagulación. Nueva York: Springer-Verlag . págs. 21-22. doi :10.1007/978-1-4615-7225-1_5. ISBN 9781461572251LCCN  83020115. OCLC  851823206. Archivado desde el original el 8 de julio de 2020. Consultado el 8 de julio de 2020 ..
  7. ^ Berne (1974), pág. 65, Fig. 4; pág. 66, texto: "En la Figura 4, los cuadrados de los diámetros se representan como una ordenada lineal y las concentraciones como una abscisa lineal... Aquí, la linealidad aparece en porciones progresivamente más grandes de la curva, correspondientes al cese del crecimiento. El gráfico es lineal en todo el rango de equivalencia;..."
  8. ^ Stanley (2002), pág. 174, figura 12-6.
  9. ^ Fahey JL, McKelvey EM (1965-01-01). "Determinación cuantitativa de inmunoglobulinas séricas en placas de agar-anticuerpo" (PDF) . Journal of Immunology . 94 (1). Baltimore, Maryland: Williams & Wilkins Co. : 84–90. doi :10.4049/jimmunol.94.1.84. ISSN  0022-1767. LCCN  52052893. OCLC  802743767. PMID  14253527. S2CID  33388724. Archivado desde el original el 25 de febrero de 2018 . Consultado el 8 de julio de 2007 ..
  10. ^ Kalff MW (marzo de 1970). "Determinación cuantitativa de los niveles de inmunoglobulina sérica mediante inmunodifusión radial simple". Bioquímica clínica . 3 (1). Elsevier : 91–104. doi :10.1016/S0009-9120(70)80011-X. PMID  4110625. Archivado desde el original el 2021-01-10 . Consultado el 2021-01-10 – vía ScienceDirect . 4. El coeficiente de variación de las determinaciones de inmunoglobulina en un lote de suero de prueba cuantificado repetidamente en el transcurso de diez meses, se tomó como medida de la reproducibilidad del método. Este coeficiente fue del 8,5% para IgG , del 5,8% para IgA y del 4,4% para IgM . Los niveles de inmunoglobulina en este suero de prueba se encontraban en el rango medio de las líneas de calibración . La precisión del método aumenta con la altura de la línea de calibración..
  11. ^ Berna (1974), pág. 63, Fig. 2; pág. 63, texto: "En la Figura 2, la concentración se representa gráficamente como una ordenada logarítmica y el diámetro medio como una abscisa lineal.... al principio el gráfico es lineal,".
  12. ^ Laboratorio de microbiología dental LSUMC/MIP (2002):
    "6. Determine la concentración del suero de prueba desconocido dibujando una curva estándar: graficando las concentraciones conocidas de los sueros de referencia versus sus diámetros de difusión en papel semilogarítmico de 2 ciclos (ver ejemplo).
    7. El gráfico de los datos de los sueros de referencia debe dar una LÍNEA RECTA, y la concentración de IgG en el suero de prueba se puede determinar con precisión".

Referencias

Lectura adicional

Enlaces externos