La expresión transitoria , más frecuentemente denominada " expresión génica transitoria ", es la expresión temporal de genes que se expresan durante un corto tiempo después de que el ácido nucleico , con mayor frecuencia ADN plasmídico que codifica un casete de expresión , se ha introducido en células eucariotas con un agente de administración químico como fosfato de calcio (CaPi) o polietilenimina (PEI). [1] Sin embargo, a diferencia de la "expresión estable", el ADN extraño no se fusiona con el ADN de la célula huésped, lo que resulta en la inevitable pérdida del vector después de varios ciclos de replicación celular. [2] La mayoría de las expresiones génicas transitorias se realizan con células animales cultivadas. La técnica también se utiliza en células vegetales; sin embargo, la transferencia de ácidos nucleicos a estas células requiere métodos diferentes a los de las células animales. Tanto en plantas como en animales, la expresión transitoria debería dar como resultado un uso limitado en el tiempo de los ácidos nucleicos transferidos, ya que cualquier expresión a largo plazo se llamaría "expresión estable".
La metodología varía según el organismo a transformar . Si bien las plantas se pueden transformar con un constructo introducido en Agrobacterium tumefaciens mediante agroinfiltración o inmersión floral, la mayoría de las células animales requerirían un vector viral . En los seres humanos, el campo de la transformación transitoria avanzó rápidamente durante la pandemia de COVID-19 de 2020-2021 con las principales vacunas contra la COVID-19 que utilizan la transferencia directa de ARNm en vectores humanos o de adenovirus , y el ARN se expresa en el ser humano huésped para producir proteínas de pico que inducen una respuesta inmunitaria.
Al elegir entre inducir una expresión transitoria o estable en las células, se deben tener en cuenta el marco temporal y el objetivo experimental. Las células transfectadas transitoriamente se utilizan a menudo para estudiar los efectos de la expresión génica a corto plazo, realizar silenciamiento génico mediado por interferencia de ARN (ARNi) o generar rápidamente proteínas recombinantes a pequeña escala. [3] Esta rápida generación de pequeñas cantidades de proteínas recombinantes se puede aplicar para evaluar su potencial como candidatos a fármacos o examinar su integridad de construcciones durante las etapas de desarrollo del vector. Además, la expresión transitoria puede ser una herramienta útil cuando se pretende optimizar parámetros seleccionados antes de someterse al lento proceso de ampliación en células transfectadas de forma estable. [4] Normalmente, las células se recolectan entre 1 y 4 días después de una transfección exitosa. Para obtener resultados aún más rápidos, reemplazar el ADN con ARNm puede dar como resultado una expresión transitoria en cuestión de minutos después de una transfección exitosa en algunos sistemas; este proceso evita la translocación al núcleo y la transcripción . [5]
Si se desea una expresión genética estable y a largo plazo, es más útil la transfección estable de células. Sin embargo, dado que la integración exitosa de un vector de ADN en el cromosoma es un hecho poco frecuente, este proceso es más difícil y requiere más tiempo, y se reserva para la producción de proteínas a gran escala, las terapias genéticas y los estudios farmacológicos a largo plazo.
La tecnología dominante utilizada para la producción de plantas transgénicas para expresión transitoria es la transformación genética mediada por Agrobacterium , o "agroinfiltración", y la maquinaria de expresión de virus. [6] Agrobacterium tumefaciens y especies relacionadas de Agrobacterium son patógenos vegetales bien conocidos que han sido diseñados para transferir eficientemente fragmentos específicos de ADN (llamado ADN de transferencia, o T-ADN) al núcleo de la planta utilizando sistemas de vectores binarios , que consisten en un vector binario de T-ADN y un plásmido auxiliar vir . [7] Este vector binario separa el T-ADN de las proteínas de virulencia que actúan en trans y que ayudan a mediar la transferencia. [8] Las ventajas de este método incluyen la modularidad de plásmidos de pequeño tamaño con una amplia gama de hospedadores a través de técnicas estándar de biología molecular. Además, dado que el plásmido inductor de tumores original en las cepas de Agrobacterium se ha desarmado y solo se han modificado células no reproductivas (a diferencia de las modificaciones de la línea germinal), el proceso se considera ambientalmente inocuo. [6]
Las aplicaciones de este proceso han dado como resultado avances en el uso de plantas para la biología sintética. Los bioproductos derivados de plantas prometen una alta competitividad frente a los sistemas tradicionales de expresión de células de mamíferos.
Los sistemas de expresión de células de mamíferos son esenciales para la producción transitoria de proteínas recombinantes y sus modificaciones postraduccionales complementarias. De hecho, aproximadamente la mitad de las proteínas terapéuticas disponibles en el mercado se producen en células de mamíferos. Sin embargo, el crecimiento lento de los sistemas de células de mamíferos, los requisitos de crecimiento precisos y el riesgo potencial de infección por virus animales presentan una serie de desafíos. Como resultado, se ha establecido un número cada vez mayor de líneas celulares de mamíferos para servir como huéspedes para la producción transitoria de proteínas recombinantes. [2]
Aunque otras líneas celulares, como la de riñón de mono verde africano (COS) y la de riñón de hámster bebé (BHK), pueden utilizarse para la producción de proteínas recombinantes, el sistema huésped más comúnmente empleado en la expresión transitoria de células de mamíferos implica derivados de la línea celular HEK293 , que se basa en la línea celular de riñón embrionario humano establecida en 1977 por Graham et al. [9] La línea celular HEK293 se creó mediante transformación con ADN de adenovirus 5 cortado. [10] Las ventajas de utilizar esta línea celular incluyen sus altas tasas de transfección y la capacidad de crecer en un medio sin suero, lo que resulta en un menor costo y un menor riesgo de contaminación con material derivado de animales que normalmente se encuentra en el suero. [2]
Posteriormente se desarrollaron varias sublíneas diseñadas mediante la incorporación de elementos virales derivados de virus de mamíferos, como el virus SV40 o el virus de Epstein-Barr (VEB), que son notables por su alta retención de ADN plasmídico en un estado episomal y su capacidad para aumentar la transcripción y la traducción a través de propiedades virales específicas. [11] En consecuencia, se identificó que estas sublíneas posteriores tenían dos componentes interactuantes: la unión del antígeno T grande SV40 al origen de replicación SV20 (SV40 ori ) y la proteína del antígeno nuclear 1 derivado del VEB ( EBNA-1 ) a su origen de replicación asociado ( oriP). [11]
Los rendimientos históricos típicos de expresión transitoria en células HEK293 transfectadas con PEI-25kDa fueron de 20 a 40 mg/L de proteína de anticuerpo recombinante. En 2008, Backliwal et. al. informaron por primera vez rendimientos que superaban 1 g/L de proteína de anticuerpo recombinante. [12]
Tradicionalmente, las células de ovario de hámster chino (CHO) se asocian con el establecimiento de líneas celulares estables para productos biológicos. Sin embargo, recientemente, los intentos de diseñar células CHO para la producción transitoria de proteínas han ganado reconocimiento. Las células CHO estuvieron entre las primeras líneas celulares establecidas para el cultivo in vitro, y su potencial como hospedador para la producción y fabricación de productos biológicos sigue siendo popular. [11] Las células CHO son preferibles para la expresión transitoria debido a su fácil escalabilidad industrial, versatilidad para la producción de diversas biomoléculas y bajo riesgo de infección de virus humanos, entre otras ventajas. [13] Se han establecido tres sistemas de expresión primarios:
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