Una transposasa pertenece a una clase de enzimas capaces de unirse al extremo de un transposón y catalizar su movimiento a otra parte de un genoma , generalmente mediante un mecanismo de cortar y pegar o un mecanismo replicativo, en un proceso conocido como transposición. La palabra "transposasa" fue acuñada por primera vez por los individuos que clonaron la enzima necesaria para la transposición del transposón Tn3 . [1] La existencia de transposones fue postulada a finales de la década de 1940 por Barbara McClintock , que estaba estudiando la herencia del maíz , pero grupos posteriores describieron la base molecular real de la transposición. McClintock descubrió que algunos segmentos de los cromosomas cambiaban de posición, saltando entre diferentes loci o de un cromosoma a otro. El reposicionamiento de estos transposones (que codificaban el color) permitió que se expresaran otros genes del pigmento. [2] La transposición en el maíz provoca cambios de color; sin embargo, en otros organismos, como las bacterias, puede provocar resistencia a los antibióticos . [2] La transposición también es importante para crear diversidad genética dentro de las especies y generar adaptabilidad a las condiciones de vida cambiantes. [3]
Las transposasas están clasificadas con el número EC EC 2.7.7. Los genes que codifican transposasas están muy extendidos en los genomas de la mayoría de los organismos y son los genes más abundantes conocidos. [4] Durante el curso de la evolución humana, hasta el 40% del genoma humano se ha movido a través de métodos como la transposición de transposones. [2]
La transposasa (Tnp) Tn5 es un miembro de la superfamilia de proteínas RNasa que incluye integrasas retrovirales . Tn5 se puede encontrar en las bacterias Shewanella y Escherichia . [5] El transposón codifica la resistencia a los antibióticos a la kanamicina y otros antibióticos aminoglucósidos. [3] [6]
Tn5 y otras transposasas son notablemente inactivas. Debido a que los eventos de transposición de ADN son inherentemente mutagénicos, la baja actividad de las transposasas es necesaria para reducir el riesgo de causar una mutación fatal en el huésped y eliminar así el elemento transposable . Una de las razones por las que Tn5 no es tan reactivo es porque los extremos N y C están ubicados relativamente cerca uno del otro y tienden a inhibirse entre sí. Esto se aclaró mediante la caracterización de varias mutaciones que dieron lugar a formas hiperactivas de transposasas. Una de esas mutaciones, L372P, es una mutación del aminoácido 372 en la transposasa Tn5. Este aminoácido es generalmente un residuo de leucina en medio de una hélice alfa. Cuando esta leucina se reemplaza con un residuo de prolina, la hélice alfa se rompe, introduciendo un cambio conformacional en el dominio C-terminal, separándolo del dominio N-terminal lo suficiente como para promover una mayor actividad de la proteína. [3] La transposición de un transposón a menudo necesita sólo tres piezas: el transposón, la enzima transposasa y el ADN objetivo para la inserción del transposón. [3] Este es el caso de Tn5, que utiliza un mecanismo de cortar y pegar para moverse alrededor de los transposones. [3]
Tn5 y la mayoría de las otras transposasas contienen un motivo DDE, que es el sitio activo que cataliza el movimiento del transposón. El aspartato-97, el aspartato-188 y el glutamato-326 forman el sitio activo, que es una tríada de residuos ácidos. [7] Se dice que el motivo DDE coordina iones metálicos divalentes, con mayor frecuencia magnesio y manganeso, que son importantes en la reacción catalítica. [7] Debido a que la transposasa es increíblemente inactiva, la región DDE muta de modo que la transposasa se vuelve hiperactiva y cataliza el movimiento del transposón. [7] El glutamato se transforma en un aspartato y los dos aspartatos en glutamatos. [7] A través de esta mutación, el estudio de Tn5 se hace posible, pero como resultado se pierden algunos pasos en el proceso catalítico. [3]
Hay varios pasos que catalizan el movimiento del transposón, incluida la unión a Tnp, la sinapsis (la creación de un complejo sináptico), la escisión, la captura del objetivo y la transferencia de cadena. Luego, la transposasa se une a la cadena de ADN y crea una abrazadera sobre el extremo del transposón del ADN y se inserta en el sitio activo. Una vez que la transposasa se une al transposón, produce un complejo sináptico en el que dos transposasas se unen en una relación cis/trans con el transposón. [3]
En la escisión, los iones de magnesio activan el oxígeno de las moléculas de agua y las exponen a un ataque nucleofílico. [6] Esto permite que las moléculas de agua corten las hebras 3' en ambos extremos y creen una formación de horquilla, que separa el transposón del ADN donante. [3] A continuación, la transposasa mueve el transposón a una ubicación adecuada. No se sabe mucho sobre la captura del objetivo, aunque existe un sesgo de secuencia que aún no se ha determinado. [3] Después de la captura del objetivo, la transposasa ataca el ADN objetivo con nueve pares de bases de diferencia, lo que resulta en la integración del transposón en el ADN objetivo. [3]
Como se mencionó anteriormente, debido a las mutaciones del DDE, algunos pasos del proceso se pierden; por ejemplo, cuando este experimento se realiza in vitro y el tratamiento térmico con SDS desnaturaliza la transposasa. Sin embargo, todavía no está claro qué sucede con la transposasa in vivo . [3]
El estudio de la transposasa Tn5 es de importancia general debido a sus similitudes con el VIH -1 y otras enfermedades retrovirales. Al estudiar Tn5, también se puede descubrir mucho sobre otras transposasas y sus actividades. [3]
Tn5 se utiliza en la secuenciación del genoma mediante el uso de Tn5 para agregar adaptadores de secuenciación y fragmentar el ADN en una única reacción enzimática en 2010, [8] reduciendo el tiempo y los requisitos de entrada en comparación con la preparación tradicional de bibliotecas de secuenciación de próxima generación . La estrategia basada en Tn5 puede simplificar significativamente el protocolo de preparación de la biblioteca e incluso puede incorporarse a la PCR de colonias directa para un gran número de aislados bacterianos sin un sesgo de cobertura obvio. [8] Las principales desventajas son un menor control del tamaño de los fragmentos en comparación con la fragmentación enzimática y la fragmentación mecánica, y un sesgo hacia un alto contenido de GC. [8] Este medio de preparación de bibliotecas también se utiliza en la técnica ATAC-seq .
La transposasa de La Bella Durmiente (SB) es la recombinasa que impulsa el sistema de transposones de La Bella Durmiente . [9] La transposasa SB pertenece a la familia de transposasas DD[E/D], que a su vez pertenece a una gran superfamilia de polinucleotidil transferasas que incluye la RNasa H, la resolvasa RuvC Holliday, las proteínas RAG y las integrasas retrovirales. [10] [11] El sistema SB se utiliza principalmente en animales vertebrados para la transferencia de genes, [12] incluida la terapia génica, [13] [14] y el descubrimiento de genes. [15] [16] El SB100X diseñado es una enzima que dirige los altos niveles de integración de transposones. [17] [18]
El transposón Tn7 es un elemento genético móvil que se encuentra en muchos procariotas como Escherichia coli ( E. coli ), y se descubrió por primera vez como una secuencia de ADN en cromosomas bacterianos y plásmidos naturales que codificaban la resistencia a los antibióticos trimetoprim y estreptomicina . [19] [20] Clasificada específicamente como un elemento transponible (transposón), la secuencia puede duplicarse y moverse dentro de un genoma mediante la utilización de una enzima recombinasa autocodificada llamada transposasa, lo que produce efectos como la creación o reversión de mutaciones y el cambio del genoma. tamaño. El transposón Tn7 ha desarrollado dos mecanismos para promover su propagación entre procariotas. [21] Como muchos otros transposones bacterianos, Tn7 se transpone a baja frecuencia y se inserta en muchos sitios diferentes con poca o ninguna selectividad de sitio. A través de esta primera vía, Tn7 se dirige preferentemente a plásmidos conjugables , que pueden replicarse y distribuirse entre bacterias. Sin embargo, Tn7 es único porque también se transpone a alta frecuencia en un único sitio específico en los cromosomas bacterianos llamado attTn7. [22] Esta secuencia específica es un gen esencial y altamente conservado que se encuentra en muchas cepas de bacterias. Sin embargo, la recombinación no es perjudicial para la bacteria huésped, ya que Tn7 en realidad se transpone aguas abajo del gen después de reconocerlo, lo que resulta en una forma segura de propagar el transposón sin matar al huésped. Esta vía de selección del sitio objetivo altamente evolucionada y sofisticada sugiere que esta vía evolucionó para promover la coexistencia entre el transposón y su huésped, así como la transmisión exitosa de Tn7 a futuras generaciones de bacterias. [21]
El transposón Tn7 tiene 14 kb de largo y codifica cinco enzimas. [21] Los extremos de la secuencia de ADN constan de dos segmentos con los que interactúa la transposasa Tn7 durante la recombinación. El segmento izquierdo (Tn7-L) tiene 150 pb de largo y la secuencia derecha (Tn7-R) tiene 90 pb de largo. Ambos extremos del transposón contienen una serie de sitios de unión de 22 pb que la transposasa Tn7 reconoce y a los que se une. Dentro del transposón hay cinco genes discretos que codifican proteínas que forman la maquinaria de transposición. Además, el transposón contiene un integrón , un segmento de ADN que contiene varios casetes de genes que codifican la resistencia a los antibióticos. [21]
El transposón Tn7 codifica cinco proteínas: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD y TnsE. [21] TnsA y TnsB interactúan entre sí para formar la enzima transposasa Tn7 TnsAB. La enzima reconoce y se une específicamente a los extremos de la secuencia de ADN del transposón y la escinde introduciendo roturas de ADN bicatenario en cada extremo. Luego, la secuencia extirpada se inserta en otro sitio de ADN objetivo. Al igual que otros transposones caracterizados, el mecanismo de transposición de Tn7 implica la escisión de los extremos 3' del ADN donante por la proteína TnsA de la transposasa TnsAB. Sin embargo, Tn7 también se escinde de forma única cerca de los extremos 5', aproximadamente a 5 pb del extremo 5' hacia el transposón Tn7, por la proteína TnsB de TnsAB. Después de la inserción del transposón en el sitio del ADN objetivo, los extremos 3' se unen covalentemente al ADN objetivo, pero los espacios de 5 pb todavía están presentes en los extremos 5'. Como resultado, la reparación de estos espacios conduce a una duplicación adicional de 5 pb en el sitio objetivo. La proteína TnsC interactúa con la enzima transposasa y el ADN objetivo para promover los procesos de escisión e inserción. La capacidad de TnsC para activar la transposasa depende de su interacción con un ADN objetivo junto con su proteína objetivo apropiada, TnsD o TnsE. Las proteínas TnsD y TnsE son selectores de objetivos alternativos que también son activadores de unión al ADN que promueven la escisión e inserción de Tn7. Su capacidad para interactuar con un ADN objetivo particular es clave para la selección del sitio objetivo de Tn7. Las proteínas TnsA, TnsB y TnsC forman así la maquinaria central de Tn7: TnsA y TnsB interactúan entre sí para formar la transposasa, mientras que TnsC funciona como regulador de la actividad de la transposasa, comunicándose entre la transposasa y TnsD y TnsE. Cuando la proteína TnsE interactúa con la maquinaria central de TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones en plásmidos conjugables. Cuando la proteína TnsD interactúa con TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones aguas abajo hacia un único sitio esencial y altamente conservado en el cromosoma bacteriano. Este sitio, attTn7, está específicamente reconocido por TnsD. [21]
