El ensayo de hemaglutinación o ensayo de hemaglutinación ( HA ) y el ensayo de inhibición de la hemaglutinación ( HI o HAI ) fueron desarrollados en 1941-42 por el virólogo estadounidense George Hirst como métodos para cuantificar la concentración relativa de virus , bacterias o anticuerpos. [1]
HA y HAI aplican el proceso de hemaglutinación , en el que los receptores de ácido siálico en la superficie de los glóbulos rojos (RBC) se unen a la glicoproteína hemaglutinina que se encuentra en la superficie del virus de la influenza (y varios otros virus) y crean una red o estructura reticular. , de glóbulos rojos y partículas de virus interconectados. [2] La red aglutinada mantiene los glóbulos rojos en una distribución suspendida, generalmente vista como una solución rojiza difusa. La formación de la red depende de las concentraciones de virus y glóbulos rojos, y cuando la concentración relativa de virus es demasiado baja, los glóbulos rojos no quedan limitados por la red y se depositan en el fondo del pozo. La hemaglutinación se observa en presencia de estafilococos, vibrios y otras especies bacterianas, similar al mecanismo que utilizan los virus para provocar la aglutinación de eritrocitos. [3] [4] Los glóbulos rojos utilizados en los ensayos de HA y HI generalmente provienen de pollos, pavos, caballos, conejillos de indias o humanos, según la selectividad del virus o bacteria objetivo y los receptores de superficie asociados en los glóbulos rojos.
Un procedimiento general para HA es el siguiente: se prepara una dilución en serie de virus a lo largo de las filas en una placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo en U o V. [5] La muestra más concentrada en el primer pocillo a menudo se diluye hasta 1/5 veces la muestra madre, y los pocillos posteriores suelen ser diluciones dobles (1/10, 1/20, 1/40, etc.). El pocillo final sirve como control negativo sin virus. Cada fila de la placa suele tener un virus diferente y el mismo patrón de diluciones. Después de diluciones en serie, se añade una concentración estandarizada de glóbulos rojos a cada pocillo y se mezcla suavemente. La placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del período de incubación, el ensayo se puede analizar para distinguir entre pocillos aglutinados y no aglutinados. Las imágenes a lo largo de una fila normalmente progresarán desde pocillos aglutinados con una alta concentración de virus y una apariencia rojiza difusa hasta una serie de pocillos con bajas concentraciones de virus que contienen un gránulo o botón de color rojo oscuro en el centro del pocillo. Los pocillos de baja concentración parecen casi idénticos al pocillo de control negativo sin virus. La apariencia del botón se produce porque los glóbulos rojos no se mantienen en la estructura reticular aglutinada y se asientan en el punto bajo del pozo del fondo en U o V. La transición de pocillos aglutinados a no aglutinados se produce de forma distintiva, en 1 o 2 pocillos.
La concentración relativa, o título, de la muestra de virus se basa en el pocillo con la última apariencia aglutinada, inmediatamente antes de que se observe un sedimento. [6] En relación con la concentración inicial de la reserva viral, la concentración de virus en este pozo será una cierta dilución de la reserva, por ejemplo, 1/40 veces. El valor del título de esa muestra es el inverso de la dilución, es decir, 40. En algunos casos, el virus inicialmente está tan diluido que nunca se observan pocillos aglutinados. En ese caso, el título de estas muestras comúnmente se asigna como 5, lo que indica la concentración más alta posible, pero la precisión de ese valor es claramente baja. Alternativamente, si la concentración relativa del virus es extremadamente alta y los pocillos nunca pasan a tener una apariencia de botón. Luego, el valor del título se asigna comúnmente a la dilución más alta, como 5120.
HI está estrechamente relacionado con el ensayo HA, pero incluye anticuerpos antivirales como "inhibidores" para interferir con la interacción virus-RBC. El objetivo es caracterizar la concentración de anticuerpos en el antisuero u otras muestras que contengan anticuerpos. [7] El ensayo HI generalmente se realiza creando una serie de diluciones de antisuero en las filas de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Cada fila normalmente sería una muestra diferente. Se agrega una cantidad estandarizada de virus o bacterias a cada pocillo y la mezcla se deja incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El último pocillo de cada fila sería un control negativo sin virus añadido. Durante la incubación, los anticuerpos se unen a las partículas virales y, si la concentración y la afinidad de unión de los anticuerpos son lo suficientemente altas, se impide eficazmente que las partículas virales causen hemaglutinación. [8] A continuación, se añade una cantidad estandarizada de glóbulos rojos a cada pocillo y se deja incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos más. Las imágenes de la placa HI resultantes generalmente progresan desde pocillos tipo “botón” no aglutinados con una alta concentración de anticuerpos hasta pocillos difusos rojos aglutinados con una baja concentración de anticuerpos. El valor del título HI es el inverso de la última dilución de suero que inhibió completamente la hemaglutinación. [9]
Las descripciones anteriores de los procesos HA y HI son generalizadas y los detalles específicos pueden variar según el operador y el laboratorio. Por ejemplo, se describen diluciones en serie a lo largo de las filas, pero algunos laboratorios utilizan una orientación alternativa y en su lugar realizan diluciones en las columnas. De manera similar, la dilución inicial, el factor de dilución en serie, los tiempos de incubación y la elección de la placa con fondo en U o en V pueden depender del laboratorio específico.
HA y HI tienen las ventajas de que los ensayos son simples, utilizan instrumentos y suministros relativamente económicos y disponibles, y proporcionan resultados en unas pocas horas. Los ensayos también están bien establecidos en muchos laboratorios de todo el mundo, lo que permite cierto grado de credibilidad, comparación y estandarización. [10] [11]
Para obtener resultados óptimos y confiables es necesario controlar varias variables, como los tiempos de incubación, la concentración de glóbulos rojos y el tipo de glóbulo rojo. [12] Los factores no específicos en la muestra pueden provocar interferencias y valores de título incorrectos. Por ejemplo, otras moléculas de la muestra distintas de los anticuerpos específicos del virus pueden inhibir la aglutinación entre el virus y los glóbulos rojos, además de bloquear potencialmente la unión del anticuerpo al virus. Las enzimas destructoras de receptores (RDE) se usan comúnmente para tratar muestras antes del análisis para prevenir una inhibición no específica. [13] El análisis de los resultados de HA o HI depende de que una persona calificada lea la placa y determine los valores de título. El método de interpretación manual introduce más oportunidades de discrepancias en el ensayo porque los resultados pueden ser subjetivos y el acuerdo entre lectores humanos es inconsistente. [14] Además, no existe un registro digital de la placa o de las determinaciones de títulos, por lo que la interpretación inicial es tediosa y comúnmente se realiza en réplicas. La variedad de posibles variables y diferencias entre lectores expertos puede dificultar la comparación de resultados entre laboratorios. [15]