La electroforesis en gel con gradiente de temperatura ( TGGE ) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante ( DGGE ) son formas de electroforesis que utilizan un gradiente de temperatura o químico para desnaturalizar la muestra a medida que se mueve a través de un gel de acrilamida . La TGGE y la DGGE se pueden aplicar a ácidos nucleicos como el ADN y el ARN , y (con menos frecuencia) a las proteínas. La TGGE se basa en cambios dependientes de la temperatura en la estructura para separar los ácidos nucleicos . La DGGE separa genes del mismo tamaño en función de su diferente capacidad desnaturalizante, que está determinada por su secuencia de pares de bases. La DGGE fue la técnica original y la TGGE un refinamiento de la misma.
La DGGE fue inventada por Leonard Lerman , mientras era profesor en SUNY Albany. [1] [2] [3]
El mismo equipo se puede utilizar para el análisis de proteínas , lo que fue realizado por primera vez por Thomas E. Creighton del Laboratorio de Biología Molecular MRC , Cambridge, Inglaterra. [4] Las proteínas y los ácidos nucleicos producen patrones de apariencia similar, pero los principios fundamentales son bastante diferentes.
La TGGE fue descrita por primera vez por Thatcher y Hodson [5] y por Roger Wartell de Georgia Tech. El grupo de Riesner en Alemania realizó un trabajo extenso. Bio-Rad, INGENY y CBS Scientific ofrecen equipos comerciales para DGGE; Biometra ofrece un sistema para TGGE.
El ADN tiene una carga negativa y, por lo tanto, se moverá hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. Un gel es una malla molecular, con agujeros aproximadamente del mismo tamaño que el diámetro de la cadena de ADN. Cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN comenzará a moverse a través del gel, a una velocidad aproximadamente inversamente proporcional a la longitud de la molécula de ADN (las longitudes más cortas de ADN viajan más rápido); esta es la base de la separación dependiente del tamaño en la electroforesis estándar .
En la TGGE también hay un gradiente de temperatura a lo largo del gel. A temperatura ambiente, el ADN existirá de forma estable en forma de doble cadena. A medida que aumenta la temperatura, las cadenas comienzan a separarse ( fusión ) y la velocidad a la que se mueven a través del gel disminuye drásticamente. Fundamentalmente, la temperatura a la que se produce la fusión depende de la secuencia (los pares de bases GC son más estables que los AT debido a las interacciones de apilamiento, no debido a la diferencia en los enlaces de hidrógeno [ cita requerida ] (hay tres enlaces de hidrógeno entre un par de bases de citosina y guanina , pero solo dos entre adenina y timina )), por lo que la TGGE proporciona un "método dependiente de la secuencia e independiente del tamaño" para separar moléculas de ADN. La TGGE separa moléculas y proporciona información adicional sobre el comportamiento de fusión y la estabilidad (Biometra, 2000).
La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) funciona aplicando una pequeña muestra de ADN (o ARN) a un gel de electroforesis que contiene un agente desnaturalizante . Los investigadores han descubierto que ciertos geles desnaturalizantes son capaces de inducir la fusión del ADN en varias etapas. Como resultado de esta fusión, el ADN se extiende a través del gel y se puede analizar en busca de componentes individuales, incluso aquellos tan pequeños como 200-700 pares de bases .
Lo que hace única a la técnica DGGE es que, a medida que el ADN se somete a condiciones de desnaturalización cada vez más extremas, las hebras fundidas se fragmentan completamente en hebras simples. El proceso de desnaturalización en un gel desnaturalizante es muy preciso: "En lugar de fundirse parcialmente de manera continua como si se tratara de una cremallera, la mayoría de los fragmentos se funden en un proceso gradual. Porciones o dominios discretos del fragmento se convierten repentinamente en hebras simples dentro de un rango muy estrecho de condiciones de desnaturalización" (Helms, 1990). Esto hace posible discernir diferencias en las secuencias de ADN o mutaciones de varios genes: las diferencias de secuencia en fragmentos de la misma longitud a menudo hacen que se fundan parcialmente en diferentes posiciones en el gradiente y, por lo tanto, se "detengan" en diferentes posiciones en el gel. Al comparar el comportamiento de fusión de los fragmentos de ADN polimórficos uno al lado del otro en geles de gradiente desnaturalizante, es posible detectar fragmentos que tienen mutaciones en el primer dominio de fusión (Helms, 1990). Al colocar dos muestras una al lado de la otra en el gel y permitir que se desnaturalicen juntas, los investigadores pueden ver fácilmente incluso las diferencias más pequeñas en dos muestras o fragmentos de ADN.
Esta técnica tiene varias desventajas: "Los gradientes químicos como los que se utilizan en la DGGE no son tan reproducibles, son difíciles de establecer y a menudo no resuelven completamente los heterodúplex " (Westburg, 2001). Estos problemas se solucionan con la TGGE, que utiliza un gradiente de temperatura, en lugar de un gradiente químico, para desnaturalizar la muestra.
Para separar los ácidos nucleicos mediante TGGE, se deben realizar los siguientes pasos: preparar y verter los geles, electroforesis, tinción y elución del ADN. Debido a que se debe elegir un sistema tamponado , es importante que el sistema permanezca estable en el contexto del aumento de la temperatura. Por lo tanto, la urea se utiliza normalmente para la preparación del gel; sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta que la cantidad de urea utilizada afectará la temperatura general requerida para separar el ADN. [6] Se carga el gel, se coloca la muestra en el gel de acuerdo con el tipo de gel que se está ejecutando, es decir, paralelo o perpendicular, se ajusta el voltaje y se puede dejar que la muestra se ejecute. [6] Dependiendo del tipo de TGGE que se vaya a ejecutar, ya sea perpendicular o paralelo , se deben preparar y cargar cantidades variables de muestra. Se utiliza una cantidad mayor de una muestra con perpendicular, mientras que se utiliza una cantidad menor de muchas muestras con TGGE paralelo. Una vez que se ha ejecutado el gel, se debe teñir el gel para visualizar los resultados. Si bien hay varias tinciones que se pueden utilizar para este propósito, la tinción de plata ha demostrado ser la herramienta más eficaz. [6] El ADN se puede eluir de la tinción de plata para su posterior análisis a través de la amplificación por PCR . [6]
TGGE y DGGE son ampliamente útiles en la investigación biomédica y ecológica; a continuación se describen aplicaciones seleccionadas.
Según una investigación reciente de Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper y Gropman, [7] la TGGE se puede utilizar para examinar el ADN mitocondrial de un individuo. Según estos autores, la TGGE se utilizó para determinar dos mutaciones novedosas en el genoma mitocondrial : "Una mujer de 21 años de edad de la que se sospechaba que padecía citopatía mitocondrial, pero que no presentaba mutaciones puntuales ni deleciones comunes del ADN mitocondrial (ADNmt), fue examinada para detectar mutaciones desconocidas en todo el genoma mitocondrial mediante electroforesis en gel con gradiente de temperatura". [8]
Lohr y colaboradores (2001) informan [ cita requerida ] que en un estudio exhaustivo de las secreciones pancreáticas de individuos sin carcinoma pancreático , se pudieron encontrar mutaciones de p53 en los jugos pancreáticos de un pequeño porcentaje de participantes. Debido a que las mutaciones de p53 se han encontrado ampliamente en carcinomas pancreáticos, los investigadores de esta investigación estaban tratando de determinar si la mutación en sí puede estar vinculada al desarrollo del cáncer de páncreas. Si bien Lohr pudo encontrar mutaciones de p53 a través de TGGE en algunos sujetos, ninguno desarrolló posteriormente carcinoma pancreático. Por lo tanto, los investigadores concluyen señalando que la mutación de p53 puede no ser el único indicador de la oncogénesis del carcinoma pancreático.
La DGGE de genes codificantes de subunidades ribosómicas pequeñas fue descrita por primera vez por Gerard Muyzer, [9] mientras realizaba un posdoctorado en la Universidad de Leiden , y se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en ecología microbiana.
La amplificación por PCR de ADN extraído de comunidades microbianas mixtas con cebadores de PCR específicos para fragmentos del gen ARNr 16S de bacterias y arqueas , y fragmentos del gen ARNr 18S de eucariotas da como resultado mezclas de productos de PCR. Debido a que todos estos amplicones tienen la misma longitud, no se pueden separar entre sí mediante electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, las variaciones de secuencia (es decir, diferencias en el contenido y la distribución de GC) entre diferentes ARNr microbianos dan como resultado diferentes propiedades de desnaturalización de estas moléculas de ADN.
Por lo tanto, los patrones de bandas DGGE se pueden utilizar para visualizar variaciones en la diversidad genética microbiana y proporcionar una estimación aproximada de la riqueza de abundancia de los miembros predominantes de la comunidad microbiana. Este método a menudo se conoce como huella de la comunidad . Recientemente, varios estudios han demostrado que la DGGE de genes funcionales (por ejemplo, genes involucrados en la reducción de azufre, fijación de nitrógeno y oxidación de amonio) puede proporcionar información sobre la función microbiana y la filogenia simultáneamente. Por ejemplo, Tabatabaei et al. (2009) aplicaron DGGE y lograron revelar el patrón microbiano durante la fermentación anaeróbica del efluente del molino de aceite de palma (POME) por primera vez. [10]