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Diagnóstico molecular

Especialista en "QIAsymphony", plataforma de automatización de pruebas de diagnóstico molecular

El diagnóstico molecular es un conjunto de técnicas utilizadas para analizar marcadores biológicos en el genoma y el proteoma , y ​​cómo sus células expresan sus genes como proteínas , aplicando la biología molecular a las pruebas médicas . En medicina, la técnica se utiliza para diagnosticar y monitorear enfermedades, detectar riesgos y decidir qué terapias funcionarán mejor para pacientes individuales, [1] [2] : prólogo  y en bioseguridad agrícola de manera similar para monitorear enfermedades de cultivos y ganado , estimar riesgos , y decidir qué medidas de cuarentena se deben tomar. [3]

Al analizar las particularidades del paciente y su enfermedad, el diagnóstico molecular ofrece la perspectiva de una medicina personalizada . [4] Estas pruebas son útiles en una variedad de especialidades médicas , incluidas enfermedades infecciosas , oncología , tipificación de antígenos leucocitarios humanos (que investiga y predice la función inmune ), coagulación y farmacogenómica : la predicción genética de qué medicamentos funcionarán mejor. [5] : v-vii  Se superponen con la química clínica (exámenes médicos en fluidos corporales).

Historia

El diagnóstico molecular utiliza técnicas como la espectrometría de masas y chips genéticos para capturar los patrones de expresión de genes y proteínas.

El campo de la biología molecular creció a finales del siglo XX, al igual que su aplicación clínica. En 1980, Yuet Wai Kan et al . sugirió una prueba genética prenatal para la talasemia que no se basaba en la secuenciación del ADN , entonces en su infancia, sino en enzimas de restricción que cortaban el ADN donde reconocían secuencias cortas específicas, creando diferentes longitudes de cadena de ADN dependiendo de qué alelo (variación genética) tuviera el feto. poseído. [6] En la década de 1980, la frase se utilizó en los nombres de empresas como Molecular Diagnostics Incorporated [7] y Bethseda Research Laboratories Molecular Diagnostics . [8] [9]

Durante la década de 1990, la identificación de genes recién descubiertos y nuevas técnicas para la secuenciación del ADN llevaron a la aparición de un campo distinto de la medicina de laboratorio molecular y genómica; en 1995 se formó la Asociación de Patología Molecular (AMP) para darle estructura. En 1999, la AMP cofundó The Journal of Medical Diagnostics . [10] Informa Healthcare lanzó Expert Reviews in Medical Diagnostics en 2001. [1] A partir de 2002, el Proyecto HapMap agregó información sobre las diferencias genéticas de una letra que se repiten en la población humana (los polimorfismos de un solo nucleótido ) y su relación con las enfermedades. . [2] : capítulo 37  En 2012, las técnicas de diagnóstico molecular para la talasemia utilizan pruebas de hibridación genética para identificar el polimorfismo de un solo nucleótido específico que causa la enfermedad de un individuo. [11]

A medida que la aplicación comercial del diagnóstico molecular se ha vuelto más importante, también lo ha hecho el debate sobre el patentamiento de los descubrimientos genéticos en su centro . En 1998, la Directiva 98/44/CE de la Unión Europea aclaró que se permitían patentes sobre secuencias de ADN. [12] En 2010, en los EE. UU., AMP demandó a Myriad Genetics para impugnar las patentes de esta última relativas a dos genes, BRCA1 y BRCA2 , que están asociados con el cáncer de mama. En 2013, la Corte Suprema de Estados Unidos estuvo parcialmente de acuerdo y dictaminó que una secuencia genética natural no podía patentarse. [13] [14]

Técnicas

El Affymetrix 5.0, un chip de microarrays

Desarrollo a partir de herramientas de investigación.

La industrialización de las herramientas de ensayo de biología molecular ha hecho que su uso en clínicas sea práctico. [2] : prólogo  La miniaturización en un único dispositivo portátil puede llevar el diagnóstico médico a la clínica, a la oficina o al hogar. [2] : prólogo  El laboratorio clínico requiere altos estándares de confiabilidad; Los diagnósticos pueden requerir acreditación o estar sujetos a regulaciones de dispositivos médicos. [15] A partir de 2011 , algunos laboratorios clínicos de EE. UU. utilizaron ensayos vendidos para "uso exclusivo de investigación". [dieciséis]

Los procesos de laboratorio deben cumplir con las regulaciones, como las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos , la Ley de Responsabilidad y Portabilidad del Seguro Médico , las Buenas Prácticas de Laboratorio y las especificaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos en los Estados Unidos. Los sistemas de gestión de información de laboratorio ayudan mediante el seguimiento de estos procesos. [17] El Reglamento se aplica tanto al personal como a los suministros. En 2012 , doce estados de EE. UU. exigen que los patólogos moleculares tengan una licencia; Varias juntas, como la Junta Estadounidense de Genética Médica y la Junta Estadounidense de Patología, certifican a tecnólogos, supervisores y directores de laboratorio. [18]

La automatización y los códigos de barras de muestras maximizan el rendimiento y reducen la posibilidad de error o contaminación durante la manipulación manual y la generación de informes de resultados. Ahora están disponibles dispositivos individuales para realizar el ensayo de principio a fin. [15]

Ensayos

El diagnóstico molecular utiliza ensayos biológicos in vitro como PCR- ELISA o hibridación fluorescente in situ . [19] [20] El ensayo detecta una molécula, a menudo en concentraciones bajas, que es un marcador de enfermedad o riesgo en una muestra tomada de un paciente. La preservación de la muestra antes del análisis es fundamental. Se debe minimizar la manipulación manual. [21] La frágil molécula de ARN plantea ciertos desafíos. Como parte del proceso celular de expresión de genes como proteínas, ofrece una medida de expresión genética, pero es vulnerable a la hidrólisis y degradación por las omnipresentes enzimas ARNasa . Las muestras pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o incubarse en agentes de conservación. [2] : capítulo 39 

Debido a que los métodos de diagnóstico molecular pueden detectar marcadores sensibles, estas pruebas son menos intrusivas que una biopsia tradicional . Por ejemplo, debido a que los ácidos nucleicos libres de células existen en el plasma humano , una simple muestra de sangre puede ser suficiente para obtener información genética de tumores, trasplantes o de un feto no nacido. [2] : capítulo 45  Muchos, pero no todos, los métodos de diagnóstico molecular basados ​​en la detección de ácidos nucleicos utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar enormemente el número de moléculas de ácido nucleico, amplificando así la secuencia objetivo en la muestra del paciente. [2] : prólogo  La PCR es un método en el que se amplifica un ADN molde utilizando cebadores sintéticos, una ADN polimerasa y dNTP. La mezcla se cicla entre al menos 2 temperaturas: una temperatura alta para desnaturalizar el ADN bicatenario en moléculas monocatenarias y una temperatura baja para que el cebador se hibride con la plantilla y para que la polimerasa extienda el cebador. En teoría, cada ciclo de temperatura duplica la cantidad de secuencia objetivo. La detección de variaciones de secuencia mediante PCR normalmente implica el diseño y uso de reactivos de oligonucleótidos que amplifican la variante de interés de manera más eficiente que la secuencia de tipo salvaje. La PCR es actualmente el método más utilizado para la detección de secuencias de ADN. [22] La detección del marcador podría utilizar PCR en tiempo real, secuenciación directa, [2] : chips de microarrays del canal 17:  chips prefabricados que prueban muchos marcadores a la vez, [2] : canal 24  o MALDI-TOF [23] Lo mismo El principio se aplica al proteoma y al genoma . Las matrices de proteínas de alto rendimiento pueden utilizar ADN o anticuerpos complementarios para unirse y, por lo tanto, pueden detectar muchas proteínas diferentes en paralelo. [24] Las pruebas de diagnóstico molecular varían ampliamente en cuanto a sensibilidad, tiempo de respuesta, costo, cobertura y aprobación regulatoria. También varían en el nivel de validación aplicado en los laboratorios que los utilizan. Por lo tanto, se requiere una validación local sólida de acuerdo con los requisitos reglamentarios y el uso de controles apropiados, especialmente cuando el resultado puede usarse para informar la decisión de tratamiento de un paciente. [25]

Beneficios

Un chip de micromatriz contiene ADN complementario (ADNc) para muchas secuencias de interés. El ADNc emite fluorescencia cuando se hibrida con un fragmento de ADN coincidente en la muestra.

Prenatal

Las pruebas prenatales convencionales para detectar anomalías cromosómicas como el síndrome de Down se basan en el análisis del número y la apariencia de los cromosomas: el cariotipo . Las pruebas de diagnóstico molecular, como la hibridación genómica comparativa con microarrays , prueban una muestra de ADN y, debido al ADN libre de células en el plasma, podrían ser menos invasivas, pero a partir de 2013 siguen siendo un complemento de las pruebas convencionales. [26]

Tratamiento

Algunos de los polimorfismos de un solo nucleótido de un paciente (ligeras diferencias en su ADN) pueden ayudar a predecir la rapidez con la que metabolizarán determinados fármacos; esto se llama farmacogenómica . [27] Por ejemplo, la enzima CYP2C19 metaboliza varios fármacos, como el agente anticoagulante clopidogrel , en sus formas activas. Algunos pacientes poseen polimorfismos en lugares específicos del gen 2C19 que los convierten en metabolizadores lentos de esos fármacos; Los médicos pueden realizar pruebas para detectar estos polimorfismos y descubrir si los medicamentos serán completamente efectivos para ese paciente. [28] Los avances en biología molecular han ayudado a demostrar que algunos síndromes que antes se clasificaban como una sola enfermedad son en realidad múltiples subtipos con causas y tratamientos completamente diferentes. El diagnóstico molecular puede ayudar a diagnosticar el subtipo (por ejemplo, de infecciones y cánceres) o el análisis genético de una enfermedad con un componente hereditario, como el síndrome de Silver-Russell . [1] [29]

Enfermedad infecciosa

El diagnóstico molecular se utiliza para identificar enfermedades infecciosas como la clamidia , [30] el virus de la influenza [31] y la tuberculosis ; [32] o cepas específicas como el virus H1N1 [33] o el SARS-CoV-2 . [34] La identificación genética puede ser rápida; por ejemplo, una prueba de amplificación isotérmica mediada por bucle diagnostica el parásito de la malaria y es lo suficientemente resistente para los países en desarrollo. [35] Pero a pesar de estos avances en el análisis del genoma, en 2013 las infecciones aún se identifican con mayor frecuencia por otros medios: su proteoma, bacteriófago o perfil cromatográfico . [36] El diagnóstico molecular también se utiliza para comprender la cepa específica del patógeno (por ejemplo, detectando qué genes de resistencia a los medicamentos posee) y, por lo tanto, qué terapias evitar. [36] Además, se pueden implementar ensayos basados ​​en secuenciación metagenómica de próxima generación para identificar organismos patógenos sin sesgos. [37]

Gestión del riesgo de enfermedades

El genoma de un paciente puede incluir una mutación hereditaria o aleatoria que afecta la probabilidad de desarrollar una enfermedad en el futuro. [27] Por ejemplo, el síndrome de Lynch es una enfermedad genética que predispone a los pacientes a sufrir cáncer colorrectal y otros tipos de cáncer; la detección temprana puede conducir a un seguimiento estrecho que mejore las posibilidades del paciente de obtener un buen resultado. [38] El riesgo cardiovascular está indicado por marcadores biológicos y las pruebas de detección pueden medir el riesgo de que un niño nazca con una enfermedad genética como la fibrosis quística . [39] Las pruebas genéticas son éticamente complejas: es posible que los pacientes no quieran el estrés de conocer su riesgo. [40] En países sin atención médica universal, un riesgo conocido puede aumentar las primas de seguro. [41]

Cáncer

El cáncer es un cambio en los procesos celulares que hacen que un tumor crezca sin control. [27] Las células cancerosas a veces tienen mutaciones en oncogenes , como KRAS y CTNNB1 (β-catenina). [42] El análisis de la firma molecular de las células cancerosas (el ADN y sus niveles de expresión a través del ARN mensajero ) permite a los médicos caracterizar el cáncer y elegir la mejor terapia para sus pacientes. [27] A partir de 2010, los ensayos que incorporan una serie de anticuerpos contra moléculas marcadoras de proteínas específicas son una tecnología emergente; Hay esperanzas para estos ensayos multiplex que podrían medir muchos marcadores a la vez. [43] Otros posibles biomarcadores futuros incluyen micromoléculas de ARN , que las células cancerosas expresan más que las sanas. [44]

El cáncer es una enfermedad con excesivas causas moleculares y en constante evolución. También hay heterogeneidad de enfermedades incluso en un individuo. Los estudios moleculares del cáncer han demostrado la importancia de las mutaciones impulsoras en el crecimiento y la metástasis de los tumores. [45] Se han desarrollado muchas tecnologías para la detección de variaciones de secuencia para la investigación del cáncer. Estas tecnologías generalmente se pueden agrupar en tres enfoques: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación y secuenciación de próxima generación (NGS). [22] Actualmente, la FDA ha aprobado muchos ensayos de PCR e hibridación como diagnósticos in vitro. [46] Sin embargo, los ensayos NGS aún se encuentran en una etapa temprana del diagnóstico clínico. [47]

Para realizar la prueba de diagnóstico molecular del cáncer, una de las cuestiones importantes es la detección de variaciones en la secuencia del ADN. Las muestras de biopsia de tumor utilizadas para el diagnóstico siempre contienen tan solo un 5 % de la variante objetivo en comparación con la secuencia de tipo salvaje. Además, para aplicaciones no invasivas de sangre periférica u orina, la prueba de ADN debe ser lo suficientemente específica como para detectar mutaciones en frecuencias alélicas variantes inferiores al 0,1%. [22]

Actualmente, al optimizar la PCR tradicional, existe un nuevo invento, el sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS), que es un método para detectar variantes de secuencia de ADN en el cáncer. El principio detrás de ARMS es que la actividad de extensión enzimática de las ADN polimerasas es altamente sensible a los desajustes cerca del extremo 3' del cebador. [22] Muchas empresas diferentes han desarrollado pruebas de diagnóstico basadas en cebadores de PCR ARMS. Por ejemplo, Qiagen therascreen, [48] Roche cobas [49] y Biomerieux THxID [50] han desarrollado pruebas de PCR aprobadas por la FDA para detectar mutaciones en el cáncer de pulmón, colon y melanoma metastásico en los genes KRAS, EGFR y BRAF. Sus kits de IVD se validaron básicamente con ADN genómico extraído de tejido FFPE.

También existen microarrays que utilizan un mecanismo de hibridación para diagnosticar el cáncer. Se pueden sintetizar más de un millón de sondas diferentes en una matriz con la tecnología Genechip de Affymetrix con un límite de detección de una a diez copias de ARNm por pocillo. [22] Generalmente se considera que los microarrays optimizados producen una cuantificación relativa repetible de diferentes objetivos. [51] Actualmente, la FDA ya ha aprobado una serie de ensayos de diagnóstico que utilizan microarrays: los ensayos MammaPrint de Agendia pueden informar el riesgo de recurrencia del cáncer de mama al perfilar la expresión de 70 genes relacionados con el cáncer de mama; [52] El ensayo autogenómico INFNITI CYP2C19 puede perfilar polimorfismos genéticos, cuyos impactos en la respuesta terapéutica a los antidepresivos son grandes; [53] y CytoScan Dx de Affymetrix pueden evaluar discapacidades intelectuales y trastornos congénitos mediante el análisis de mutaciones cromosómicas. [54]

En el futuro, las herramientas de diagnóstico del cáncer probablemente se centrarán en la secuenciación de próxima generación (NGS). Al utilizar la secuenciación de ADN y ARN para realizar diagnósticos de cáncer, la tecnología en el campo de las herramientas de diagnóstico molecular se desarrollará mejor. Aunque el rendimiento y el precio de NGS se han reducido drásticamente en los últimos 10 años aproximadamente 100 veces, todavía estamos a al menos 6 órdenes de magnitud de distancia de realizar una secuenciación profunda a nivel del genoma completo. [22] Actualmente, Ion Torrent desarrolló algunos paneles NGS basados ​​en AmpliSeq traslacional, por ejemplo, el Oncomine Comprehensive Assay. [55] Se están centrando en la utilización de secuenciación profunda de genes relacionados con el cáncer para detectar variantes de secuencia raras.

La herramienta de diagnóstico molecular se puede utilizar para evaluar el riesgo de cáncer. Por ejemplo, la prueba BRCA1/2 de Myriad Genetics evalúa el riesgo de cáncer de mama de las mujeres a lo largo de su vida. [22] Además, algunos cánceres no siempre se manifiestan con síntomas claros. Es útil analizar a las personas cuando no presentan síntomas evidentes y así poder detectar el cáncer en etapas tempranas. Por ejemplo, la prueba ColoGuard se puede utilizar para detectar cáncer colorrectal en personas mayores de 55 años . [56] El cáncer es una enfermedad de larga duración con varios pasos de progresión; las herramientas de diagnóstico molecular se pueden utilizar para el pronóstico de la progresión del cáncer. Por ejemplo, la prueba OncoType Dx de Genomic Health puede estimar el riesgo de cáncer de mama. Su tecnología puede informar a los pacientes que busquen quimioterapia cuando sea necesario examinando los niveles de expresión de ARN en el tejido de la biopsia del cáncer de mama. [57]

Con el creciente apoyo gubernamental al diagnóstico molecular del ADN, se espera que pronto esté disponible un número cada vez mayor de ensayos clínicos de detección de ADN para cánceres. Actualmente, la investigación en el diagnóstico del cáncer se está desarrollando rápidamente con objetivos de menor costo, menor consumo de tiempo y métodos más simples para médicos y pacientes.

Ver también

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