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Cromosoma artificial de levadura

Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son cromosomas modificados genéticamente derivados del ADN de la levadura, Saccharomyces cerevisiae [1], que luego se liga a un plásmido bacteriano. Al insertar fragmentos grandes de ADN, de 100 a 1000 kb, las secuencias insertadas se pueden clonar y mapear físicamente mediante un proceso llamado caminata cromosómica . Este es el proceso que se utilizó inicialmente para el Proyecto Genoma Humano , sin embargo, debido a problemas de estabilidad, los YAC se abandonaron para el uso de cromosomas artificiales bacterianos [2].

La levadura de panadería S. cerevisiae es uno de los organismos experimentales más importantes para el estudio de la genética molecular eucariota. [1]

A partir de la investigación inicial de Rankin et al., Strul et al. y Hsaio et al., el cromosoma inherentemente frágil se estabilizó al descubrir la secuencia de replicación autónoma (ARS) necesaria; [2] Murray et al. describieron en 1983 un YAC refinado que utilizaba estos datos. [3]

Los componentes principales de un YAC son el ARS, el centrómero [3] y los telómeros [4] de S. cerevisiae . Además, se utilizan genes marcadores seleccionables, como la resistencia a los antibióticos y un marcador visible, para seleccionar las células de levadura transformadas. Sin estas secuencias, el cromosoma no será estable durante la replicación extracelular y no se distinguiría de las colonias sin el vector. [4]

Esta es una fotografía de dos copias de la Biblioteca YAC del Genoma Humano de la Universidad de Washington. Cada una de las pilas tiene aproximadamente 12 placas de microtitulación. Cada placa tiene 96 pocillos, cada uno con diferentes clones de levadura.

Construcción

Un YAC se construye utilizando un plásmido de ADN circular inicial , que normalmente se corta en una molécula de ADN lineal utilizando enzimas de restricción ; luego se utiliza la ADN ligasa para ligar una secuencia de ADN o un gen de interés en el ADN linealizado, formando una única pieza grande y circular de ADN. [3] [5] La generación básica de cromosomas artificiales de levadura lineales se puede dividir en 6 pasos principales:

  1. Ligación de un marcador seleccionable en un vector plasmídico: esto permite la selección diferencial de colonias con o sin el gen marcador. Un gen de resistencia a los antibióticos permite que el vector YAC se amplifique y seleccione en E. coli al permitir que la E. coli que contiene el vector YAC sobreviva en presencia de un antibiótico. El sitio de clonación del vector YAC para el ADN extraño se encuentra dentro del gen SUP4 . Este gen compensa una mutación en la célula huésped de levadura que causa la acumulación de pigmento rojo. Las células huésped normalmente son rojas, y aquellas transformadas solo con YAC formarán colonias incoloras. La clonación de un fragmento de ADN extraño en el YAC causa la inactivación insercional del gen, restaurando el color rojo. Por lo tanto, las colonias que contienen el fragmento de ADN extraño son rojas. [5]
  2. Ligadura de secuencias centroméricas necesarias para la estabilidad mitótica [6]
  3. Ligación de secuencias de replicación autónoma (ARS) que proporciona un origen de replicación para llevar a cabo la replicación mitótica. Esto permite que el plásmido se replique extracromosómicamente, pero hace que el plásmido sea altamente inestable mitóticamente y se pierda fácilmente sin las secuencias centroméricas. [4] [7]
  4. Ligadura de secuencias teloméricas artificiales para convertir un plásmido circular en un fragmento lineal de ADN [8]
  5. Inserción de secuencia de ADN a amplificar (hasta 1000kb)
  6. Colonia de levadura de transformación [9]

Cromosoma III completo

El cromosoma III es el tercer cromosoma más pequeño en S. cerevisiae; su tamaño se estimó a partir de estudios de electroforesis en gel de campo pulsado en 300–360 kb [10].

Este cromosoma ha sido objeto de un estudio intensivo, sobre todo porque contiene los tres loci genéticos implicados en el control del tipo de apareamiento: MAT, HML y HMR. [11] En marzo de 2014, Jef Boeke, del Centro Médico Langone de la Universidad de Nueva York, publicó que su equipo había sintetizado uno de los 16 cromosomas de levadura de S. cerevisiae , el cromosoma III, al que denominó synIII. [12] [13] El procedimiento implicó reemplazar los genes en el cromosoma original con versiones sintéticas y el cromosoma sintetizado terminado se integró luego en una célula de levadura. Requirió diseñar y crear 273.871 pares de bases de ADN, menos que los 316.667 pares del cromosoma original.

Usos en biotecnología

Los vectores de expresión de levadura, como los YAC, los YIps (plásmidos de integración de levadura) y los YEps (plásmidos episomales de levadura), tienen una ventaja sobre los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) en el sentido de que pueden utilizarse para expresar proteínas eucariotas que requieren una modificación postraduccional . Al poder insertar grandes fragmentos de ADN, los YAC pueden utilizarse para clonar y ensamblar los genomas completos de un organismo. [14] Con la inserción de un YAC en células de levadura, pueden propagarse como cromosomas artificiales lineales, clonando las regiones de ADN insertadas en el proceso. Una vez completado esto, se pueden utilizar dos procesos para obtener un genoma secuenciado o una región de interés:

  1. Mapeo físico [6]
  2. Caminata cromosómica [15]

Esto es importante porque permite el mapeo detallado de regiones específicas del genoma. Se han examinado cromosomas humanos completos, como el cromosoma X, [16] generando la ubicación de marcadores genéticos para numerosos trastornos y rasgos genéticos. [17]

Esquema del plásmido pBR322 generado en el Laboratorio Boyer de la UC San Francisco por Bolívar y Rodríguez en 1972. Es uno de los primeros vectores y más utilizados, y la base de los YAC creados por Murray y Szostak en 1983. El plásmido contiene genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina, y un conjunto de sitios diana de enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN.

El Proyecto Genoma Humano

En los Estados Unidos, el Proyecto Genoma Humano tomó forma clara por primera vez en febrero de 1988, con la publicación del informe del Consejo Nacional de Investigación (NRC) Mapping and Sequencing the Human Genome. [18] Los YAC son significativamente menos estables que los BAC, produciendo "efectos quiméricos": artefactos donde la secuencia del ADN clonado en realidad no corresponde a una sola región genómica sino a múltiples regiones. El quimerismo puede deberse a la coligación de múltiples segmentos genómicos en un solo YAC, o a la recombinación de dos o más YAC transformados en la misma célula de levadura huésped. [19] La incidencia del quimerismo puede ser tan alta como el 50%. [20] Otros artefactos son la eliminación de segmentos de una región clonada y la reorganización de segmentos genómicos (como la inversión). En todos estos casos, la secuencia determinada a partir del clon YAC es diferente de la secuencia natural original, lo que conduce a resultados inconsistentes y errores de interpretación si se confía en la información del clon. Debido a estos problemas, el Proyecto Genoma Humano finalmente abandonó el uso de YAC y cambió a cromosomas artificiales bacterianos , donde la incidencia de estos artefactos es muy baja. Además de los problemas de estabilidad, específicamente la ocurrencia relativamente frecuente de eventos quiméricos, los YAC demostraron ser ineficientes al generar la ruta de mosaico mínima que cubre todo el genoma humano. Generar las bibliotecas de clones requiere mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza de la dependencia de los sitios etiquetados con secuencia (STS) como punto de referencia al seleccionar clones apropiados, existen grandes brechas que necesitan una mayor generación de bibliotecas para abarcarlas. Es este obstáculo adicional lo que impulsó al proyecto a utilizar BAC en su lugar. [21] Esto se debe a dos factores: [22]

  1. Los BAC se generan mucho más rápido y, al generar bibliotecas redundantes de clones, esto es esencial.
  2. Los BAC permiten una cobertura más densa con STS, lo que da como resultado rutas de mosaico mínimas más completas y eficientes generadas in silico.

Sin embargo, es posible utilizar ambos enfoques, como se demostró cuando se estudió el genoma del nematodo C. elegans . La mayor parte del genoma estaba cubierto con BAC y los espacios vacíos se rellenaron con YAC. [21]

Véase también

Referencias

  1. ^ Biología molecular de la levadura Saccharomyces: metabolismo y expresión génica. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. 1982. ISBN 0-87969-149-2.
  2. ^ Hsiao CL, Carbon J (agosto de 1979). "Transformación de alta frecuencia de levadura mediante plásmidos que contienen el gen ARG4 de levadura clonado". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 76 (8): 3829–33. Bibcode :1979PNAS...76.3829H. doi : 10.1073/pnas.76.8.3829 . PMC 383928 . PMID  386351. 
  3. ^ ab Murray AW, Szostak JW (1983). "Construcción de cromosomas artificiales en levadura". Nature . 305 (5931): 189–93. Bibcode :1983Natur.305..189M. doi :10.1038/305189a0. PMID  6350893. S2CID  4337825.
  4. ^ ab Ratzkin B, Carbon J (febrero de 1977). "Expresión funcional del ADN de levadura clonado en Escherichia coli". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 74 (2): 487–91. Bibcode :1977PNAS...74..487R. doi : 10.1073/pnas.74.2.487 . PMC 392314 . PMID  322128. 
  5. ^ Strachan T. (2011). Genética molecular humana / Tom Strachan y Andrew Read, 4ª ed.
  6. ^ Clarke L, Carbon J (octubre de 1980). "Aislamiento de un centrómero de levadura y construcción de cromosomas circulares pequeños funcionales". Nature . 287 (5782): 504–9. Bibcode :1980Natur.287..504C. doi :10.1038/287504a0. PMID  6999364. S2CID  4348814.
  7. ^ Struhl K, Stinchcomb DT, Scherer S, Davis RW (marzo de 1979). "Transformación de alta frecuencia de la levadura: replicación autónoma de moléculas de ADN híbridas". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 76 (3): 1035–9. Bibcode :1979PNAS...76.1035S. doi : 10.1073/pnas.76.3.1035 . PMC 383183 . PMID  375221. 
  8. ^ Kiss GB, Amin AA, Pearlman RE (junio de 1981). "Dos regiones separadas del ácido desoxirribonucleico ribosómico extracromosómico de Tetrahymena thermophila permiten la replicación autónoma de plásmidos en Saccharomyces cerevisiae". Biología molecular y celular . 1 (6): 535–43. doi :10.1128/mcb.1.6.535. PMC 369696 . PMID  6765606. 
  9. ^ Burke DT, Carle GF, Olson MV (mayo de 1987). "Clonación de grandes segmentos de ADN exógeno en levaduras mediante vectores cromosómicos artificiales". Science . 236 (4803): 806–12. Bibcode :1987Sci...236..806B. doi :10.1126/science.3033825. PMID  3033825.
  10. ^ Oliver, SG; et al. (mayo de 1992). "La secuencia completa de ADN del cromosoma III de la levadura". Nature . 357 (6373): 38–46. Bibcode :1992Natur.357...38O. doi :10.1038/357038a0. PMID  1574125. S2CID  4271784.
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  14. ^ Burke, D., Carle, G. y Olson, M. Clonación de grandes segmentos de ADN exógeno en levadura mediante vectores cromosómicos artificiales. Science 236, 806–812 (1987).
  15. ^ Kere, J.; Nagaraja, R.; Mumm, S.; Ciccodicola, A.; D'Urso, M. (1992). "Mapeo de cromosomas humanos mediante el desplazamiento con sitios marcados con secuencias a partir de fragmentos finales de insertos cromosómicos artificiales de levadura". Genómica . 14 (2): 241–248. doi :10.1016/s0888-7543(05)80212-5. PMID  1427839.
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