La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, comúnmente conocida como NASBA , es un método en biología molecular que se utiliza para producir múltiples copias de ARN monocatenario. [1] NASBA es un proceso de dos pasos que toma ARN y hibrida cebadores especialmente diseñados, luego utiliza un cóctel de enzimas para amplificarlo. [2]
Fondo
La amplificación de ácidos nucleicos es una técnica utilizada para producir varias copias de un segmento específico de ARN/ADN. [3] El ARN y el ADN amplificados se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, como genotipado, secuenciación y detección de bacterias o virus. [4] Hay dos tipos diferentes de amplificación, no isotérmica e isotérmica. [5] La amplificación no isotérmica produce múltiples copias de ARN/ADN mediante ciclos reiterativos entre diferentes temperaturas. [6] La amplificación isotérmica produce múltiples copias de ARN/ADN a una temperatura de reacción constante. [7] NASBA toma ARN monocatenario, hibrida cebadores a 65°C y luego lo amplifica a 41°C para producir múltiples copias de ARN monocatenario. [8] Para que se produzca una amplificación exitosa, se utiliza un cóctel de enzimas que contiene transcriptasa inversa de mieloblastosis aviar (AMV-RT), RNasa H y ARN polimerasa. [9] AMV-RT sintetiza una cadena de ADN complementaria (ADNc) a partir del molde de ARN una vez que se hibrida el cebador. [10] La RNasa H luego degrada la plantilla de ARN y el otro cebador se une al ADNc para formar ADN bicatenario, que la ARN polimerasa utiliza para sintetizar copias de ARN. [11] Un aspecto clave de NASBA es que el material inicial y el producto final es siempre ARN monocatenario. Dicho esto, se puede utilizar para amplificar el ADN, pero el ADN debe traducirse a ARN para que se produzca una amplificación exitosa.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es otra técnica de amplificación isotérmica.
Historia
NASBA fue desarrollado por J Compton en 1991, quien lo definió como "una tecnología dependiente de cebadores que puede usarse para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una única mezcla a una temperatura". [12] Inmediatamente después de la invención de NASBA, se utilizó para el diagnóstico rápido y la cuantificación del VIH-1 en el suero de los pacientes. [13] Aunque el ARN también se puede amplificar mediante PCR utilizando una transcriptasa inversa (para sintetizar una cadena de ADN complementaria como plantilla), la principal ventaja de NASBA es que funciona en condiciones isotérmicas, generalmente a una temperatura constante de 41 °C o dos temperaturas diferentes, dependiendo de los cebadores y enzimas utilizados. Incluso cuando se aplican dos temperaturas diferentes, todavía se considera isotérmico, porque no oscila entre esas temperaturas. NASBA se puede utilizar en diagnóstico médico como una alternativa a la PCR que es más rápida y sensible en algunas circunstancias. [14]
Procedimiento
Explicado brevemente, NASBA funciona de la siguiente manera:
- Plantilla de ARN agregada a la mezcla de reacción, el primer cebador con la región promotora T7 en su extremo 5' se une a su sitio complementario en el extremo 3' de la plantilla.
- La transcriptasa inversa sintetiza la cadena de ADN complementaria opuesta que extiende el extremo 3' del cebador y se mueve hacia arriba a lo largo del molde de ARN.
- La ARNasa H destruye el molde de ARN del compuesto ADN-ARN (la ARNasa H sólo destruye el ARN en híbridos ARN-ADN, pero no el ARN monocatenario).
- El segundo cebador se une al extremo 5' de la cadena de ADN (antisentido).
- La transcriptasa inversa sintetiza nuevamente otra cadena de ADN a partir del cebador adjunto, lo que da como resultado un ADN de doble cadena.
- La ARN polimerasa T7 se une a la región promotora de la doble hebra. Dado que la ARN polimerasa T7 sólo puede transcribir en la dirección 3' a 5' [15], se transcribe el ADN sentido y se produce un ARN antisentido. Esto se repite y la polimerasa produce continuamente cadenas de ARN complementarias de este molde, lo que da como resultado la amplificación.
- Ahora puede comenzar una fase cíclica similar a los pasos anteriores. Aquí, sin embargo, el segundo cebador se une primero al (-)ARN
- La transcriptasa inversa ahora produce un dúplex (+)cDNA/(-)RNA.
- La ARNasa H vuelve a degradar el ARN y el primer cebador se une al +(ADNc), ahora monocatenario.
- La transcriptasa inversa ahora produce el ADN (-) complementario, creando un dúplex de ADNbc
- Exactamente como en el paso 6, la polimerasa T7 se une a la región promotora para producir ARN (-) y el ciclo se completa.
Aplicaciones clínicas
La técnica NASBA se ha utilizado para desarrollar pruebas de diagnóstico rápido para varios virus patógenos con genomas de ARN monocatenario, por ejemplo, influenza A, [16] virus del Zika, virus de la fiebre aftosa , [17] síndrome respiratorio agudo severo ( SARS ). -Coronavirus asociado , [18] bocavirus humano (HBoV) [19] y también parásitos como Trypanosoma brucei . [20]
Recientemente, se desarrolló la reacción NASBA con fluorescencia, tira reactiva y lectura de secuenciación de próxima generación para el diagnóstico de COVID-19. [21]
Ver también
Referencias
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