El sistema Strep-tag es un método que permite la purificación y detección de proteínas mediante cromatografía de afinidad . El Strep-tag II es un péptido sintético formado por ocho aminoácidos ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Esta secuencia peptídica exhibe afinidad intrínseca hacia Strep-Tactin, una estreptavidina diseñada específicamente , y puede fusionarse en el extremo N o C terminal a proteínas recombinantes. Aprovechando la interacción altamente específica, las proteínas marcadas con Strep se pueden aislar en un solo paso a partir de lisados celulares crudos. Debido a que Strep -tag eluye en condiciones fisiológicas suaves, es especialmente adecuado para la generación de proteínas funcionales. [1] [2]
Strep-tag, Twin-Strep-tag y Strep-Tactin son marcas comerciales registradas de IBA Lifesciences GmbH .
La estreptavidina es una proteína tetramérica expresada en Streptomyces avidinii . Debido a la alta afinidad de la estreptavidina por la vitamina H ( biotina ), la estreptavidina se usa comúnmente en los campos de la biología molecular y la biotecnología . La etiqueta Strep se seleccionó originalmente de una biblioteca genética para unirse específicamente a una versión "central" proteolíticamente truncada de estreptavidina. Con el paso de los años, el Strep-tag se optimizó sistemáticamente para permitir una mayor flexibilidad en la elección del sitio de fijación. Además, su compañero de interacción, la estreptavidina, también se optimizó para aumentar la capacidad de unión a péptidos, lo que dio lugar al desarrollo de Strep-Tactin. La afinidad de unión de Strep-tag a Strep-Tactin es casi 100 veces mayor que la de Strep-tag a Streptavidin. El llamado sistema Strep-tag, compuesto por Strep-tag y Strep-Tactin, ha demostrado ser especialmente útil para el aislamiento funcional y el análisis de complejos proteicos en la investigación del proteoma . [3]
Al igual que otras etiquetas de corta afinidad ( etiqueta His , etiqueta FLAG ), la etiqueta Strep se puede fusionar fácilmente con proteínas recombinantes durante la subclonación de su ADNc o gen . Para su expresión, se encuentran disponibles diversos vectores para diversos organismos huéspedes ( E. coli , levaduras , insectos y células de mamíferos ). [4] Un beneficio particular de Strep-tag es su tamaño bastante pequeño y el hecho de que es bioquímicamente casi inerte . Por lo tanto, el plegamiento o la secreción de proteínas no se ve influenciado y, por lo general, no interfiere con la función de las proteínas. Strep-tag es especialmente adecuado para el análisis de proteínas funcionales, porque el procedimiento de purificación puede realizarse en condiciones fisiológicas. Esto no sólo permite el aislamiento de proteínas sensibles en estado nativo, sino que también es posible purificar complejos proteicos intactos, [5] incluso si solo una subunidad porta la etiqueta.
En el primer paso del ciclo de purificación de Strep-tag, el lisado celular que contiene la proteína de fusión Strep-tag se aplica a una columna con Strep-tactina inmovilizada (paso 1). Después de que la proteína marcada se haya unido específicamente a Strep-Tactin, un breve paso de lavado con un tampón fisiológico (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, PBS) elimina todas las demás proteínas del huésped (paso 2). Esto se debe a la baja tendencia de Strep-Tactin a unirse a proteínas de forma no específica. Luego, la proteína de fusión Strep-tag purificada se eluye suavemente con una baja concentración de destiobiotina, que compite específicamente por la bolsa de unión de biotina (paso 3). Para regenerar la columna, la destiobiotina se elimina mediante la aplicación de una solución que contiene HABA (un colorante azoico amarillo ). La eliminación de destiobiotina se indica mediante un cambio de color de amarillo anaranjado a rojo (paso 4+5). Finalmente, la solución de HABA se lava con un pequeño volumen de tampón de purificación, lo que deja la columna lista para usar en la siguiente purificación.
El sistema Strep-tag ofrece una herramienta selectiva para purificar proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas obtenidas son bioactivas y presentan una pureza muy elevada (superior al 95%). Además, el sistema Strep-tag se puede utilizar para la detección de proteínas en varios ensayos. Dependiendo de las circunstancias experimentales, se utilizan anticuerpos Strep-tag o Strep-Tactin, con un marcador enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP)) o fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP)). Si se requiere una alta pureza, el lisado se puede purificar usando primero Strep-Tactin y luego realizando una segunda ejecución usando anticuerpos contra Strep-tag. Esto reduce la contaminación con proteínas unidas inespecíficas, que puede ocurrir en algunos escenarios raros.
Se pueden realizar los siguientes ensayos utilizando el sistema de detección Strep-tag:
Debido a que Strep-tag es capaz de aislar complejos proteicos, también se pueden llevar a cabo estrategias para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Otra opción es la inmovilización de proteínas Strep-tag con un anticuerpo específico de alta afinidad en microplacas o biochips.
El sistema Strep-Tag/StrepTactin también se utiliza en pinzas ópticas de una sola molécula y en experimentos con microscopio de fuerza atómica , y muestra una alta estabilidad mecánica comparable a los enlaces no covalentes más fuertes disponibles actualmente. [6]