Las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real ( MIQE ) son un conjunto de protocolos para realizar y comunicar experimentos y datos cuantitativos de PCR en tiempo real , tal como lo idearon Bustin et al. en 2009. [1] Se idearon después de que se publicara un artículo en 2002 que afirmaba detectar el virus del sarampión en niños con autismo mediante el uso de RT-qPCR, pero los resultados demostraron ser completamente irreproducibles por otros científicos. [2] Los propios autores tampoco intentaron reproducirlos y se descubrió que los datos sin procesar tenían una gran cantidad de errores y equivocaciones básicas en el análisis. Este incidente impulsó a Stephen Bustin a crear las directrices MIQE para proporcionar un nivel de calidad de referencia para los datos de qPCR publicados en la literatura científica. [2]
Las directrices MIQE se crearon debido a la baja calidad de los datos de qPCR enviados a las revistas académicas en ese momento, lo que se estaba volviendo más común a medida que la maquinaria de secuenciación de próxima generación permitía realizar dichos experimentos a un costo más bajo. Debido a que la técnica se utiliza en toda la ciencia en múltiples campos, los instrumentos, métodos y diseños de cómo se utiliza la qPCR difieren enormemente. Para ayudar a mejorar la calidad general, las directrices MIQE se elaboraron como sugerencias generalizadas sobre procedimientos experimentales básicos y formas de datos que deberían recopilarse como un nivel mínimo de información reportada para que otros investigadores comprendan y utilicen al leer el material publicado. Establecer un conjunto de directrices reconocidas y ampliamente consensuadas como estas fue considerado importante por la comunidad científica, especialmente debido a la cantidad cada vez mayor de trabajo científico proveniente de países en desarrollo con muchos idiomas y protocolos diferentes. [3]
En 2009, Stephen Bustin dirigió un grupo internacional de científicos, entre ellos Mikael Kubista, para elaborar un conjunto de directrices sobre cómo realizar la qPCR y qué tipos de datos se deberían recopilar y publicar en el proceso. [1] Esto también permitió a los editores y revisores de revistas científicas emplear las directrices al revisar un artículo enviado que incluía datos de qPCR. Por lo tanto, las directrices se establecieron como una especie de lista de verificación para cada paso del procedimiento, en la que ciertos elementos se marcaban como esenciales (E) al enviar datos para su publicación y otros como simplemente deseables (D). [4]
En septiembre de 2010 se publicó una versión adicional de las directrices para su uso con PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. También actuó como resumen de la forma más amplia de las directrices. [5] Otros investigadores han estado creando versiones adicionales para formas específicas de qPCR que pueden requerir un conjunto complementario o diferente de elementos para verificar, incluida la qPCR de una sola célula [6] y la PCR digital (dPCR). [7] También se ha revisado la adherencia adecuada a las directrices MIQE existentes en otras áreas científicas, incluida la fotobiomodulación [8] y los biomarcadores clínicos . [9]
Bustin señaló en 2014 (y de nuevo en 2017) que había cierta aceptación y uso de las directrices MIQE dentro de la comunidad científica, pero todavía había demasiados artículos publicados con experimentos de qPCR que carecían incluso de la presentación de datos más básica y de la confirmación adecuada de la eficacia de dichos datos. Estos estudios conservaban importantes problemas de reproducibilidad, donde las conclusiones de su evidencia no podían ser replicadas por otros investigadores, poniendo en duda los resultados iniciales. Todo esto se produjo a pesar de que muchos artículos citaban directamente la publicación original de Bustin en MIQE, pero no seguían la lista de verificación de las directrices del material en sus propios experimentos. [2] [10] Sin embargo, algunos investigadores han señalado al menos cierto éxito, ya que varias publicaciones académicas rechazaron una serie de artículos para su publicación debido a que no pasaban las listas de verificación de MIQE. Otros estudios se han retractado después del hecho una vez que se notó su falta de datos adecuados para pasar las directrices MIQE y se señaló públicamente a los editores de la revista. [11]
Al configurar sus nuevos sistemas comparativos de qPCR denominados "Dots in Boxes" en 2017, New England Biolabs afirmó que habían diseñado la parte de recopilación de datos en torno a las pautas MIQE para que los datos se ajustaran a todas las listas de verificación de parámetros mínimos en los protocolos. [12] Otras empresas de instrumentos científicos han ayudado a cumplir con las pautas al adaptar deliberadamente sus dispositivos para ellas, incluida Bio-Rad, que creó una aplicación móvil que permite marcar activamente la lista de verificación MIQE a medida que se completa cada paso. [13]
En junio de 2020 se realizó una revisión del décimo aniversario desde la publicación de las pautas del MIQE y se analizaron los estudios científicos que habían producido resultados mejores y más organizados al seguir las pautas. [14] En agosto de 2020, se publicó una versión actualizada de las pautas para el método de PCR digital para dar cuenta de la mejora en la maquinaria, las tecnologías y las técnicas desde la publicación original de 2013. Se agregaron pasos de pautas adicionales para el análisis de datos, al mismo tiempo que se proporcionó una tabla de lista de verificación más simplificada para que la usen los investigadores. [15] Se desarrolló un ensayo de orientación RT-qPCR junto con Stephen Bustin utilizando las pautas del MIQE para biomarcadores clínicos en diciembre de 2020 con el fin de identificar la presencia clínica de partículas virales de COVID-19 durante la pandemia de COVID-19 . [16]
Las pautas de MIQE se dividen en nueve secciones diferentes que conforman la lista de verificación. Estas incluyen no solo consideraciones para realizar la qPCR en sí, sino también cómo se recopilan, analizan y presentan los datos resultantes. Una parte importante de esto último es incluir información relacionada con el software de análisis utilizado y también enviar los datos sin procesar a las bases de datos pertinentes. [1]
Gran parte de las directrices incluyen acciones básicas que normalmente se incluirían en experimentos y publicaciones, como un elemento para describir las diferencias entre los grupos experimental y de control. Otra información similar incluye cuántas unidades individuales se utilizan en cada grupo en el experimento. Estas dos partes se definen como esenciales para cualquier estudio. Esta sección también incluye dos puntos deseables, que son señalar si el propio laboratorio del autor o un laboratorio central de la universidad u organización realizó el ensayo de qPCR y un reconocimiento a cualquier otra persona que haya contribuido al trabajo. [1]
Los requisitos esenciales que deben cumplir las muestras y el material de muestra incluyen una descripción de la muestra, qué tipo de disección se utilizó, qué método de procesamiento se realizó, si las muestras se congelaron o fijaron y cuánto tiempo tomó, y qué condiciones de muestra se utilizaron. También es conveniente saber el volumen o la masa de la muestra que se procesó para la qPCR. [1]
Para el proceso de extracción de ADN/ARN, existen una serie de pautas esenciales. Estas incluyen una descripción del proceso de extracción realizado, una declaración sobre qué kit de extracción de ADN se utilizó y cualquier cambio realizado en las instrucciones, detalles sobre si se utilizó algún tratamiento con DNasa o RNasa , una declaración sobre si se evaluó alguna contaminación, una cuantificación de la cantidad de material genético extraído, una descripción de los instrumentos utilizados para la extracción, los métodos utilizados para conservar la integridad del ARN, una declaración sobre el número de integridad del ARN y el indicador de calidad y el ciclo de cuantificación (Cq) alcanzado, y por último qué pruebas se realizaron para determinar la presencia o ausencia de inhibidores . Cuatro datos deseados son de dónde se obtuvieron los reactivos utilizados, qué nivel de pureza genética se obtuvo, qué rendimiento se obtuvo y una imagen de gel de electroforesis para confirmación. [1]
Las partes esenciales principales para esta fase incluyen detallar las condiciones de reacción en su totalidad, dando tanto la cantidad de ARN utilizado como el volumen total de la reacción, dar información sobre el oligonucleótido utilizado como cebador y su concentración, la concentración y el tipo de transcriptasa inversa utilizada y, por último, la temperatura y la cantidad de tiempo empleado para la reacción. También es deseable tener los números de catálogo de los reactivos utilizados y sus fabricantes, la desviación estándar para el Cq con y sin la transcriptasa involucrada, y cómo se almacenó el ADNc . [1]
Aquí es necesaria toda la información básica sobre el objetivo, incluido el símbolo del gen, el número de base de datos de acceso para la secuencia en cuestión, la longitud de la secuencia que se está amplificando, información sobre el análisis de especificidad utilizado, como BLAST , qué variantes de empalme existen para la secuencia y dónde se encuentra el exón o intrón de cada cebador. Hay varios datos deseados, pero no obligatorios para esta sección, como la ubicación del amplicón , si existen pseudogenes u homólogos , si se realizó una alineación de secuencias y los datos obtenidos de ella, y cualquier dato sobre la estructura secundaria de la secuencia amplificada. [1]
La creación de oligonucleótidos requiere sólo dos datos esenciales: las secuencias de cebadores utilizadas y la ubicación y los detalles de cualquier modificación realizada en la secuencia. Pero hay varios datos deseables, incluido el número de identificación de la base de datos RTPrimerDB, las secuencias de las sondas , el fabricante utilizado para fabricar los oligonucleótidos y cómo se purificaron. [1]
Como uno de los segmentos principales de las pautas, hay varias partes esenciales en la lista de verificación para el proceso de qPCR en sí. Esto incluye el conjunto completo de condiciones utilizadas para la reacción, el volumen tanto de la reacción como del ADNc, las concentraciones de las sondas, iones de magnesio y dNTP , qué tipo de polimerasa se utilizó y su concentración, qué kit se utilizó y su fabricante, qué aditivos para la reacción se utilizaron, quién fabricó la máquina de qPCR y qué parámetros se establecieron para el proceso de termociclado . Los únicos datos adicionales deseados son la composición química del tampón utilizado, quién fabricó las placas y los tubos utilizados y cuál es su número de catálogo, y si la reacción se configuró manualmente o mediante una máquina. [1] [17]
Para confirmar la efectividad y calidad del proceso de qPCR que se realizó, hay varias acciones y datos posteriores que deben presentarse. Esto incluye explicar el método específico para verificar que el proceso funcionó, como usar un gel, secuenciación directa del material genético, mostrar un perfil de fusión o de digestión con enzima de restricción . Si se utilizó SYBR Green I , se debe proporcionar el Cq del grupo de control sin ADN molde. Otros datos esenciales incluyen la calibración de las curvas de la máquina con la pendiente y la intersección y anotadas, la eficiencia del proceso de PCR determinada a partir de la pendiente mencionada anteriormente, los coeficientes de correlación (r al cuadrado) para las curvas de calibración, el rango dinámico de las curvas lineales, el Cq encontrado en la concentración más baja donde el 95% de los resultados aún fueron positivos ( LOD ) junto con la evidencia del LOD en sí y, por último, si se utiliza un multiplex , se debe proporcionar la eficiencia y el LOD para cada ensayo realizado. [1] [17]
La información adicional deseada incluye evidencia de que la optimización de qPCR ocurrió mediante el uso de gradientes, los intervalos de confianza para mostrar la eficiencia de la qPCR y los intervalos de confianza para todo el rango probado. [1]
La sección final de las directrices incluye información sobre cómo se realizó el análisis de los datos de qPCR. Las partes esenciales de esto incluyen el programa y la versión del programa utilizados para el análisis, el método para determinar el Cq, determinar los puntos atípicos en los datos y cómo se utilizan o excluyen y por qué, qué resultados se encontraron para los controles sin material genético molde, una explicación de por qué se eligieron los genes de referencia utilizados y por qué se eligió la cantidad de ellos, el método utilizado para normalizar los datos, cuántas réplicas técnicas se incluyeron, cuán repetibles fueron los datos dentro de los ensayos, qué métodos se utilizaron para determinar la significancia de los resultados y qué software se utilizó para esta parte del análisis cualitativo. [1]
También se desea incluir información sobre el número de réplicas biológicas y si coinciden con los resultados de las réplicas técnicas, los datos de reproducibilidad de las variantes de concentración, datos sobre el análisis de potencia y, por último, que los investigadores envíen los datos sin procesar en el formato de archivo RDML. [1] [18]