Un cultivo microbiológico , o cultivo microbiano , es un método de multiplicación de organismos microbianos dejándolos reproducirse en un medio de cultivo predeterminado bajo condiciones controladas de laboratorio. Los cultivos microbianos son métodos de diagnóstico básicos y fundamentales que se utilizan como herramientas de investigación en biología molecular .
El término cultivo también puede referirse a los microorganismos que se cultivan.
Los cultivos microbianos se utilizan para determinar el tipo de organismo, su abundancia en la muestra que se está analizando o ambas cosas. Es uno de los principales métodos de diagnóstico de la microbiología y se utiliza como herramienta para determinar la causa de una enfermedad infecciosa al dejar que el agente se multiplique en un medio predeterminado. Por ejemplo, un cultivo de garganta se toma raspando el revestimiento de tejido en la parte posterior de la garganta y secando la muestra en un medio para poder detectar microorganismos dañinos, como Streptococcus pyogenes , el agente causante de la faringitis estreptocócica. [1] Además, el término cultivo se usa de manera más general e informal para referirse al "cultivo selectivo" de un tipo específico de microorganismo en el laboratorio.
A menudo es esencial aislar un cultivo puro de microorganismos. Un cultivo puro (o axénico ) es una población de células u organismos multicelulares que crecen en ausencia de otras especies o tipos. Un cultivo puro puede originarse a partir de una sola célula o un solo organismo, en cuyo caso las células son clones genéticos unas de otras. Con el fin de gelificar el cultivo microbiano, se utiliza el medio de gel de agarosa ( agar ). El agar es una sustancia gelatinosa derivada de las algas marinas . Un sustituto barato del agar es la goma guar , que se puede utilizar para el aislamiento y mantenimiento de termófilos .
El primer medio de cultivo fue el medio líquido, diseñado por Louis Pasteur en 1860. [2] Este se utilizó en el laboratorio hasta que Robert Koch desarrolló el medio sólido en 1881. [3] El método de Koch de utilizar una placa plana para sus medios sólidos fue reemplazado por la caja redonda de Julius Richard Petri en 1887. [2] Desde estas invenciones fundamentales, ha evolucionado una amplia gama de medios y métodos para ayudar a los científicos a cultivar, identificar y purificar cultivos de microorganismos.
El cultivo de procariotas generalmente involucra bacterias, ya que las arqueas son difíciles de cultivar en un entorno de laboratorio. [4] Para obtener un cultivo procariota puro, se debe iniciar el cultivo a partir de una sola célula o una sola colonia del organismo. [5] Dado que una colonia procariota es la descendencia asexual de una sola célula, todas las células son genéticamente idénticas y darán como resultado un cultivo puro.
Los cultivos de virus y fagos requieren células hospedadoras en las que el virus o el fago se multiplique. En el caso de los bacteriófagos, los cultivos se desarrollan infectando células bacterianas. A continuación, el fago se puede aislar de las placas resultantes en un césped de bacterias en una placa. Los cultivos virales se obtienen de sus células hospedadoras eucariotas apropiadas. El método de la placa de estrías es una forma de separar físicamente la población microbiana y se realiza esparciendo el inóculo de un lado a otro con un asa de inoculación sobre la placa de agar sólido. Tras la incubación , surgirán colonias y se habrán aislado células individuales de la biomasa . Una vez que se ha aislado un microorganismo en un cultivo puro, es necesario conservarlo en un estado viable para su posterior estudio y uso en cultivos denominados cultivos madre. Estos cultivos deben mantenerse de forma que no se pierdan sus caracteres biológicos, inmunológicos y culturales.
Los cultivos de células eucariotas proporcionan un entorno controlado para estudiar organismos eucariotas . Los eucariotas unicelulares, como las levaduras, las algas y los protozoos, pueden cultivarse de forma similar a los cultivos procariotas. Lo mismo ocurre con los eucariotas microscópicos multicelulares, como C. elegans .
Aunque los organismos eucariotas macroscópicos son demasiado grandes para ser cultivados en un laboratorio, las células extraídas de estos organismos pueden cultivarse. Esto permite a los investigadores estudiar partes y procesos específicos de un eucariota macroscópico in vitro .
Un método de cultivo microbiológico es el cultivo líquido, en el que los organismos deseados se suspenden en un medio nutritivo líquido, como el caldo Luria , en un matraz vertical. Esto permite a un científico cultivar grandes cantidades de bacterias u otros microorganismos para una variedad de aplicaciones posteriores.
Los cultivos líquidos son ideales para la preparación de un ensayo antimicrobiano en el que el caldo líquido se inocula con bacterias y se deja crecer durante la noche (se puede utilizar un "agitador" para mezclar mecánicamente el caldo y fomentar un crecimiento uniforme). Posteriormente, se toman alícuotas de la muestra para analizar la actividad antimicrobiana de un fármaco o proteína específicos ( péptidos antimicrobianos ).
Como alternativa, se pueden utilizar cultivos líquidos estáticos. Estos cultivos no se agitan y proporcionan a los microbios un gradiente de oxígeno. [6]
Los cultivos microbiológicos se pueden cultivar en placas de Petri de diferentes tamaños que tengan una capa fina de medio de crecimiento a base de agar. Una vez que el medio de crecimiento en la placa de Petri se inocula con las bacterias deseadas, las placas se incuban a la temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias seleccionadas (por ejemplo, generalmente a 37 grados Celsius, o la temperatura corporal humana , para cultivos de humanos o animales, o a una temperatura más baja para cultivos ambientales). Una vez que se alcanza el nivel de crecimiento deseado, las placas de agar se pueden almacenar boca abajo en un refrigerador durante un período prolongado para conservar las bacterias para experimentos futuros.
Hay una variedad de aditivos que se pueden agregar al agar antes de verterlo en una placa y dejarlo solidificar. Algunos tipos de bacterias solo pueden crecer en presencia de ciertos aditivos. Esto también se puede utilizar al crear cepas de bacterias modificadas que contienen un gen de resistencia a los antibióticos . Cuando se agrega el antibiótico seleccionado al agar, solo las células bacterianas que contienen el gen insertado que confiere resistencia podrán crecer. Esto permite al investigador seleccionar solo las colonias que se transformaron con éxito.
Las versiones miniaturizadas de las placas de agar implementadas en formatos de tiras reactivas, por ejemplo, Dip Slide, Digital Dipstick [7] muestran potencial para ser utilizadas en el punto de atención con fines de diagnóstico . Tienen ventajas sobre las placas de agar, ya que son rentables y su funcionamiento no requiere experiencia ni entorno de laboratorio, lo que permite su uso en el punto de atención.
Los medios selectivos y diferenciales revelan características de los microorganismos que se cultivan en ellos. Este tipo de medios pueden ser selectivos, diferenciales o tanto selectivos como diferenciales. El cultivo en múltiples tipos de medios selectivos y diferenciales puede purificar cultivos mixtos y revelar a los científicos las características necesarias para identificar cultivos desconocidos.
Los medios selectivos se utilizan para distinguir organismos permitiendo que un tipo específico de organismo crezca en ellos mientras que inhiben el crecimiento de otros. Por ejemplo, el azul de metileno eosina (EMB) se puede utilizar para seleccionar bacterias Gram-positivas, la mayoría de las cuales tienen un crecimiento inhibido en EMB, y seleccionar bacterias Gram-negativas, cuyo crecimiento no se inhibe en EMB. [8]
Los científicos utilizan medios diferenciales al cultivar microorganismos para revelar ciertas características bioquímicas de los organismos. Estos rasgos revelados pueden luego compararse con los atributos de microorganismos conocidos en un esfuerzo por identificar cultivos desconocidos. Un ejemplo de esto es el agar MacConkey (MAC), que revela bacterias fermentadoras de lactosa a través de un indicador de pH que cambia de color cuando se producen ácidos a partir de la fermentación. [9]
En los paneles multiobjetivo, las bacterias aisladas de una colonia cultivada previamente se distribuyen en cada pocillo, cada uno de los cuales contiene medio de crecimiento, así como los ingredientes para una prueba bioquímica, que cambiará la absorbancia del pocillo dependiendo de la propiedad bacteriana para el objetivo probado. El panel se incubará en una máquina, que posteriormente analiza cada pocillo con un método basado en la luz, como colorimetría, turbidimetría o fluorometría. [10] Los resultados combinados se compararán automáticamente con una base de datos de resultados conocidos para varias especies bacterianas, con el fin de generar un diagnóstico de qué especie bacteriana está presente en el panel actual. Simultáneamente, realiza pruebas de susceptibilidad a los antibióticos .
Los cultivos por punción son similares a las placas de agar, pero se forman con agar sólido en un tubo de ensayo. Las bacterias se introducen a través de una aguja de inoculación o la punta de una pipeta que se pincha en el centro del agar. Las bacterias crecen en el área perforada. [11] Los cultivos por punción se utilizan con mayor frecuencia para el almacenamiento o envío a corto plazo de cultivos. Además, los cultivos por punción pueden revelar características sobre los microorganismos cultivados, como la motilidad o los requisitos de oxígeno.
Para cultivos en placa sólida de microorganismos termófilos como Bacillus acidocaldarius, Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus y Thermus thermophilus , etc. que crecen a temperaturas de 50 a 70 grados C, se ha demostrado que la goma gellan clarificada con bajo contenido de acilo es el agente gelificante preferido en comparación con el agar para el recuento o aislamiento o ambos de las bacterias termófilas mencionadas anteriormente. [12]
Las colecciones de cultivos microbianos se centran en la adquisición, autenticación, producción, preservación, catalogación y distribución de cultivos viables de microorganismos de referencia estándar , líneas celulares y otros materiales para la investigación en sistemática microbiana . [13] [14] Las colecciones de cultivos también son repositorios de cepas tipo .
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