La cromatografía en columna en química es un método de cromatografía que se utiliza para aislar un único compuesto químico de una mezcla. La cromatografía es capaz de separar sustancias basándose en la adsorción diferencial de compuestos al adsorbente; Los compuestos se mueven a través de la columna a diferentes velocidades, lo que permite separarlos en fracciones. La técnica es ampliamente aplicable, ya que se pueden utilizar muchos adsorbentes diferentes (fase normal, fase reversa u otros) con una amplia gama de disolventes. La técnica se puede utilizar en escalas desde microgramos hasta kilogramos. La principal ventaja de la cromatografía en columna es el costo relativamente bajo y la desechabilidad de la fase estacionaria utilizada en el proceso. Este último previene la contaminación cruzada y la degradación de la fase estacionaria debido al reciclaje. La cromatografía en columna se puede realizar usando la gravedad para mover el solvente o usando gas comprimido para empujar el solvente a través de la columna.
Una cromatografía de capa fina puede mostrar cómo se comportará una mezcla de compuestos cuando se purifica mediante cromatografía en columna. La separación se optimiza primero mediante cromatografía en capa fina antes de realizar la cromatografía en columna.
Una columna se prepara empaquetando un adsorbente sólido en un tubo cilíndrico de vidrio o plástico. El tamaño dependerá de la cantidad de compuesto que se aísle. La base del tubo contiene un filtro, ya sea un tapón de algodón o lana de vidrio, o frita de vidrio para mantener la fase sólida en su lugar. Se puede colocar un depósito de disolvente en la parte superior de la columna.
Generalmente se utilizan dos métodos para preparar una columna: el método seco y el método húmedo. Para el método seco, la columna se llena primero con polvo de fase estacionaria seca, seguido de la adición de fase móvil, que se pasa a través de la columna hasta que esté completamente húmeda y, a partir de este punto, nunca se permite que funcione en seco. [1] Para el método húmedo, se prepara una suspensión del eluyente con el polvo de la fase estacionaria y luego se vierte cuidadosamente en la columna. La parte superior de la sílice debe ser plana y puede protegerse con una capa de arena. El eluyente se hace pasar lentamente a través de la columna para hacer avanzar el material orgánico.
Los componentes individuales son retenidos de forma diferente en la fase estacionaria y se separan entre sí mientras circulan a diferentes velocidades a través de la columna con el eluyente. Al final de la columna eluyen uno a la vez. Durante todo el proceso de cromatografía, el eluyente se recoge en una serie de fracciones . Las fracciones se pueden recoger automáticamente mediante recolectores de fracciones. La productividad de la cromatografía se puede aumentar ejecutando varias columnas a la vez. En este caso se utilizan recolectores de múltiples flujos. La composición del flujo de eluyente se puede controlar y cada fracción se analiza en busca de compuestos disueltos, por ejemplo, mediante cromatografía analítica, espectros de absorción UV o fluorescencia . Los compuestos coloreados (o compuestos fluorescentes con ayuda de una lámpara UV) se pueden ver a través de la pared de vidrio como bandas móviles.
La fase estacionaria o adsorbente en la cromatografía en columna es un sólido. La fase estacionaria más común para la cromatografía en columna es el gel de sílice , seguida por la alúmina . En el pasado se ha utilizado frecuentemente polvo de celulosa . Se encuentra disponible una amplia gama de fases estacionarias para realizar cromatografía de intercambio iónico , cromatografía de fase reversa (RP), cromatografía de afinidad o adsorción en lecho expandido (EBA). Las fases estacionarias suelen ser polvos o geles finamente molidos y/o son microporosas para una mayor superficie, aunque en EBA se utiliza un lecho fluidizado. Existe una relación importante entre el peso de la fase estacionaria y el peso seco de la mezcla de analitos que se puede aplicar a la columna. Para la cromatografía en columna de sílice, esta relación se encuentra entre 20:1 y 100:1, dependiendo de qué tan cerca unos de otros se eluyen los componentes del analito. [2]
La fase móvil o eluyente es un disolvente o una mezcla de disolventes utilizados para mover los compuestos a través de la columna. Se elige de modo que el valor del factor de retención del compuesto de interés sea aproximadamente de 0,2 - 0,3 para minimizar el tiempo y la cantidad de eluyente para ejecutar la cromatografía. El eluyente también se ha elegido de forma que los diferentes compuestos puedan separarse eficazmente. El eluyente se optimiza en pruebas previas a pequeña escala, a menudo utilizando cromatografía en capa fina (TLC) con la misma fase estacionaria, utilizando disolventes de diferente polaridad hasta que se encuentra un sistema disolvente adecuado. Los disolventes de fase móvil comunes, en orden de polaridad creciente, incluyen hexano , diclorometano , acetato de etilo , acetona y metanol . [3] Un sistema disolvente común es una mezcla de hexano y acetato de etilo, con proporciones ajustadas hasta que el compuesto objetivo tenga un factor de retención de 0,2 - 0,3. Contrariamente a la idea errónea común, el metanol solo puede usarse como eluyente para compuestos altamente polares y no disuelve el gel de sílice.
Existe un caudal óptimo para cada separación particular. Un caudal más rápido del eluyente minimiza el tiempo necesario para hacer funcionar una columna y, por tanto, minimiza la difusión, lo que da como resultado una mejor separación. Sin embargo, el caudal máximo es limitado porque se requiere un tiempo finito para que el analito se equilibre entre la fase estacionaria y la fase móvil; consulte la ecuación de Van Deemter . Una sencilla columna de laboratorio funciona mediante flujo por gravedad . El caudal de dicha columna se puede aumentar extendiendo la columna llena de eluyente fresco por encima de la parte superior de la fase estacionaria o disminuir mediante los controles del grifo. Se pueden lograr caudales más rápidos usando una bomba o usando gas comprimido (por ejemplo, aire, nitrógeno o argón ) para empujar el disolvente a través de la columna (cromatografía en columna flash). [4] [5]
El tamaño de partícula de la fase estacionaria es generalmente más fino en la cromatografía en columna flash que en la cromatografía en columna por gravedad. Por ejemplo, uno de los grados de gel de sílice más utilizados en la primera técnica es la malla de 230 – 400 (40 – 63 µm), mientras que la última técnica normalmente requiere gel de sílice de malla de 70 – 230 (63 – 200 µm). [6]
Se ha desarrollado una hoja de cálculo que ayuda al desarrollo exitoso de columnas flash. La hoja de cálculo estima el volumen de retención y el volumen de banda de los analitos, los números de fracciones que se espera que contengan cada analito y la resolución entre picos adyacentes. Esta información permite a los usuarios seleccionar parámetros óptimos para separaciones a escala preparativa antes de intentar la columna flash. [7]
La cromatografía en columna es una etapa que requiere mucho tiempo en cualquier laboratorio y puede convertirse rápidamente en un cuello de botella para cualquier laboratorio de procesos. Muchos fabricantes como Biotage, Buchi, Interchim y Teledyne Isco han desarrollado sistemas de cromatografía flash automatizados (normalmente conocidos como LPLC, cromatografía líquida de baja presión, alrededor de 350 a 525 kPa o 50,8 a 76,1 psi) que minimizan la participación humana en el proceso de purificación. Los sistemas automatizados incluirán componentes que normalmente se encuentran en sistemas de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) más costosos, como una bomba de gradiente, puertos de inyección de muestras, un detector UV y un colector de fracciones para recolectar el eluyente. Normalmente, estos sistemas automatizados pueden separar muestras desde unos pocos miligramos hasta una escala industrial de muchos kilogramos y ofrecen una solución mucho más económica y rápida para realizar múltiples inyecciones en sistemas de HPLC de preparación.
La resolución (o la capacidad de separar una mezcla) en un sistema LPLC siempre será menor en comparación con la HPLC, ya que el material de relleno en una columna de HPLC puede ser mucho más pequeño, típicamente solo 5 micrómetros, lo que aumenta el área de superficie de la fase estacionaria y las interacciones superficiales. y dando una mejor separación. Sin embargo, el uso de este pequeño medio de relleno provoca una alta contrapresión y es por eso que se denomina cromatografía líquida de alta presión. Las columnas LPLC suelen estar rellenas con sílice de alrededor de 50 micrómetros, lo que reduce la contrapresión y la resolución, pero también elimina la necesidad de costosas bombas de alta presión. Los fabricantes ahora están comenzando a pasar a sistemas de cromatografía flash de mayor presión y los han denominado sistemas de cromatografía líquida de media presión (MPLC) que operan por encima de 1 MPa (150 psi).
Normalmente, la cromatografía en columna se configura con bombas peristálticas, tampones que fluyen y la muestra de solución a través de la parte superior de la columna. Las soluciones y los tampones pasan a través de la columna donde un recolector de fracciones al final de la configuración de la columna recolecta las muestras eluidas. Antes de la recogida de la fracción, las muestras que se eluyen de la columna pasan a través de un detector como un espectrofotómetro o un espectrómetro de masas para que pueda determinarse la concentración de las muestras separadas en la mezcla de solución de muestra.
Por ejemplo, si tuviera que separar dos proteínas diferentes con diferentes capacidades de unión a la columna de una muestra de solución, un buen tipo de detector sería un espectrofotómetro que utilice una longitud de onda de 280 nm. Cuanto mayor sea la concentración de proteína que pasa a través de la solución eluida a través de la columna, mayor será la absorbancia de esa longitud de onda.
Debido a que la cromatografía en columna tiene un flujo constante de solución eluida que pasa a través del detector en concentraciones variables, el detector debe representar gráficamente la concentración de la muestra eluida a lo largo del tiempo. Este gráfico de concentración de muestra versus tiempo se llama cromatograma.
El objetivo final de la cromatografía es separar diferentes componentes de una mezcla de solución. La resolución expresa el grado de separación entre los componentes de la mezcla. Cuanto mayor sea la resolución del cromatograma, mejor será el grado de separación de las muestras que proporcionará la columna. Estos datos son una buena manera de determinar las propiedades de separación de la columna de esa muestra en particular. La resolución se puede calcular a partir del cromatograma.
Las curvas separadas en el diagrama representan diferentes perfiles de concentración de elución de muestras a lo largo del tiempo según su afinidad por la resina de la columna. Para calcular la resolución, se requiere el tiempo de retención y el ancho de la curva.
El tiempo de retención es el tiempo desde el inicio de la detección de la señal por parte del detector hasta la altura máxima del perfil de concentración de elución de cada muestra diferente.
El ancho de la curva es el ancho de la curva del perfil de concentración de las diferentes muestras en el cromatograma en unidades de tiempo.
Un método simplificado para calcular la resolución del cromatograma es utilizar el modelo de placa. [8] El modelo de placas supone que la columna se puede dividir en un cierto número de secciones o placas y que el balance de masa se puede calcular para cada placa individual. Este enfoque se aproxima a una curva de cromatograma típica como una curva de distribución gaussiana . Al hacer esto, el ancho de la curva se estima como 4 veces la desviación estándar de la curva, 4σ. El tiempo de retención es el tiempo desde el inicio de la detección de la señal hasta el momento de la altura máxima de la curva gaussiana.
A partir de las variables de la figura anterior, la resolución, el número de placa y la altura de la placa del modelo de placa de columna se pueden calcular mediante las ecuaciones:
Resolución (R s ):
dónde:
Número de placa (N):
Altura de la placa (H):
donde L es la longitud de la columna. [8]
Para una columna de adsorción, la resina de la columna (la fase estacionaria) está compuesta de microperlas. Incluso partículas más pequeñas, como proteínas, carbohidratos, iones metálicos u otros compuestos químicos, se conjugan en las microperlas. Se puede suponer que cada partícula de unión que está unida a la microperla se une en una proporción de 1:1 con la muestra de soluto enviada a través de la columna que necesita ser purificada o separada.
La unión entre la molécula diana que se va a separar y la molécula de unión en las perlas de la columna se puede modelar usando una reacción de equilibrio simple K eq = [CS]/([C][S]) donde K eq es la constante de equilibrio , [C] y [S] son las concentraciones de la molécula diana y la molécula de unión en la resina de la columna, respectivamente. [CS] es la concentración del complejo de la molécula objetivo unida a la resina de la columna. [8]
Usando esto como base, se pueden utilizar tres isotermas diferentes para describir la dinámica de unión de una cromatografía en columna: lineal, Langmuir y Freundlich.
La isoterma lineal ocurre cuando la concentración del soluto necesario a purificar es muy pequeña en relación con la molécula de unión. Por tanto, el equilibrio se puede definir como:
Para usos a escala industrial, se deben tener en cuenta las moléculas de unión totales en las perlas de resina de la columna porque se deben tener en cuenta los sitios desocupados. La isoterma de Langmuir y la isoterma de Freundlich son útiles para describir este equilibrio. La isoterma de Langmuir viene dada por:
La isoterma de Freundlich viene dada por:
La isoterma de Freundlich se utiliza cuando la columna puede unirse a muchas muestras diferentes en la solución que debe purificarse. Debido a que las diferentes muestras tienen diferentes constantes de unión a las perlas, hay muchas K eq s diferentes. Por tanto, la isoterma de Langmuir no es un buen modelo de vinculación en este caso. [8]
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